血液检验 8.2017-2014级检验本科红细胞检验2 学习资料

第七章

红细胞检验的基本方法南方医科大学检验系孙德华主要内容红细胞酶缺陷的检验血红蛋白异常的检验陈发性睡眠性血红蛋白尿症的检验免疫性溶血性贫血的检验(五)红细胞酶缺陷的检验高铁血红蛋白还原试验变性珠蛋白小体生成试验葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定谷胱甘肽还原酶缺陷检测1.高铁血红蛋白还原试验

methemoglobinreductiontest,MHb-RT原理在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白变成MHb（褐色），正常红细胞的Ｇ-6-PD催化戊糖旁路使NADP（氧化型辅酶Ⅱ）变成NADPH（还原型辅酶Ⅱ），其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（Fe3+)还原成亚铁血红蛋白（Fe2+）（红色），通过比色可观察还原的多少。当G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。6-磷酸葡萄糖NADP还原型亚甲蓝高铁血红蛋白(Fe3+)

G-6-PD高铁血红蛋白还原酶6-磷酸葡萄糖酸NADPH氧化型亚甲蓝血红蛋白(Fe2+)

高铁血红蛋白还原实验(MHb-RT）原理

Fe2+Fe3+

亚硝酸盐

Fe3+Fe2+

亚甲蓝

G-6PDNADP

NADPH

比色参考值

正常人高铁血红蛋白还原率≧75%脐带血≧77%

临床评价G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏时（杂合子）为31%-74%严重缺乏（半杂合子或纯合子）﹤30%注意事项（1）红细胞比积低于30％时，高铁血红蛋白还原率显著降低，必须调整红细胞与血浆的比例，直到1：1；（2）草酸盐具有还原性，不能作为抗凝剂；（3）标本不应有凝血或溶血；（4）测定吸光度波长应准确：635nm。2.变性珠蛋白小体生成试验原理G-6-PD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37℃孵育2-4小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞中珠蛋白小体的生成情况，计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。参考值正常人含5个及5个以上珠蛋白小体的红细胞一般﹤30%。临床评价G-6-PD缺乏症常高于45%，故可作为G-6-PD缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%-84%，HbH病和化学物质中毒时也增高。3.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定原理在G-6-PD和NADP+存在下,G-6-PD能使NADP+

还原成为NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。NADP+

NADPH

（340nm）

G-6-PD参考值和临床意义正常人有很强荧光。G-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光;杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光.正常人酶活性为(12.1±2.09)U/gHb(Zinkham法）。G-6-PD缺陷者见于蚕豆病和伯氨喹啉型药物性溶血性贫血等。附注：（1）本法特异性较好，可直接测定G6PD活性；（2）每次试验要有G6PD正常和缺陷的标本作对照；（3）贫血患者取血量可稍多；（4）干血滤纸片邮寄某中心检测时，应同时邮寄正常对照血样品。原理4.丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定二磷酸腺苷（ADP）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）丙酮酸NAD+乳酸ATPNADH丙酮酸激酶PKLDH340nm处有吸收峰无参考值正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb临床评价荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏中间缺乏（杂合子）时，荧光25-60分钟消失严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失参考值正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb临床评价荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏中间缺乏（杂合子）时，荧光25-60分钟消失严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失。5.谷胱甘肽还原酶缺陷检测原理谷胱甘肽还原酶（glutathionreductase,GR)催化反应中NADPH转化为NADP+，荧光消失，通过在340nm处观察荧光斑点消失的时间（GR荧光斑点试验）反映谷胱甘肽还原酶的活性，或直接测定340nm吸光度的变化（GR活性定量试验）计算GR的活性。NADPHNADP+谷胱甘肽还原酶参考值GR荧光斑点试验：正常人荧光斑点15min内消失GR活性定量：（7.17±1.09）U/gHb临床评价谷胱甘肽还原酶缺乏时，GR荧光斑点试验15分钟以后还有荧光存在，GR活性定量试验活性低于7.17U/gHb。红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症检验

glucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency高铁血红蛋白还原试验G-6-PD荧光斑点试验(ICSH推荐筛查方法)硝基四氮唑蓝试验（NBT）纸片法变性珠蛋白小体（Heinz小体）生成试验红细胞G-6-PD活性测定分子生物学法确诊试验筛选试验(六)血红蛋白异常的检验红细胞包涵体试验血红蛋白电泳检测抗碱血红蛋白检测HbF酸洗脱法检测异丙醇沉淀试验热变性试验聚丙烯酰胺凝胶电泳检测尿素裂解试验高压电泳检测血红蛋白基因PCR技术检测原理1.红细胞包涵体试验

Heinz-bodyformingtrest煌焦油蓝液+新鲜血液37度孵育不稳定血红蛋白易变性沉淀包涵体参考值正常人﹤0.01（1%）临床评价不稳定血红蛋白病孵育1-3小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。G-6-PD缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。HbH病孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。注意事项：

观察结果注意与网织红细胞鉴别，HbH包涵体为大小不等、数目不一的墨绿蓝色小体，后者包涵体一般呈蜘网状，且很快显现；

2.血红蛋白电泳检测

hemoglobineletroporesis原理不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动。经一定电压和时间的电泳，不同的血红蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带同时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。参考值pH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与HbBarts不能分开和显示.PH６.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳

主要用于HbH和HbBarts的检出。HbH等电点为5.6，在PH6.5TEB缓冲液中电泳时泳向阳极，HbBarts则在点样点不动，而其余的血红蛋都向阴极移动。临床评价发现异常血红蛋白区带，如HbH、HbE、HbBarts、HbD和HbC等。HbA2增多，见于β珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。HbE病时也在HbA2区带位置处增加，但含量很大（在10％以上）。HbA2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。区带示意图：CA2EDSGLPQAFMKJNBartsHI适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与HbBarts不能分开和显示.主要用于HbH和HbBarts的检出。HbH等电点为5.6，在PH6.5TEB缓冲液中电泳时泳向阳极，HbBarts则在点样点不动，而其余的血红蛋都向阴极移动。

1、琼脂糖电泳

2、毛细管电泳

3、高效液相色谱仪（HPLC）目前常用血红蛋白电泳技术：PrinCE450高效毛细管电泳仪L-2000高效液相色谱仪HPLC3.抗碱血红蛋白检测原理胎儿血红蛋白（HbF）具有比HbA更强的抗碱作用，将待检的溶血液与一定量的NaOH溶液混合，作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱性反应。HbF抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，HbA变性沉淀，取上清于540nm处测定吸光度，检测出HbF的浓度。此试验也称为碱变性试验，其检测的是抗碱血红蛋白，除HbF外，HbBarts和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别。参考值成人：1.0-3.1％新生儿：55-85％临床评价绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血时HbF增加，重型者达30％～90％，中间型常为5％～30％，轻型者小于5％。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100％。相对增多：可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、PNH、卟啉病等。生理性增多：见于孕妇和新生儿。4.HbF酸洗脱法检测原理HbF具有抗碱和抗酸能力比HbA强。将血涂片于酸性缓冲液孵育，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。参考值正常血片中含HbF的着色红细胞：成人<0.02(2%);新生儿0.55-0.85(55%-85%)，以后渐渐下降;孕妇可有轻度增加。临床评价珠蛋白合成障碍性贫血着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染成红色，轻型患者可见少数染成红色的细胞。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。5.异丙醇沉淀试验原理不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更易裂解在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶液中，不稳定血红蛋白更快的沉淀通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。参考值正常人血红蛋白液为阴性（30分钟内不沉淀）临床评价不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现沉淀,20分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。本试验特异性差，为不稳定血红蛋白的过筛试验。注意事项：

（1）异丙醇溶液浓度（17％）及温度（37℃）应严格控制，PH只不得低于7.2；

（2）血红蛋白浓度应控制在70-130g/L之间，最好为100g/L；

（3）血红蛋白液需新鲜配置，久置可变为高铁血红蛋白，造成假阳性。6.热变性试验

Heatinstabilitytest原理热变性试验是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在50℃时作用2小时，是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。参考值阴性：2小时不会或仅有微细沉淀，热沉淀的血红蛋白<5%。临床评价血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在。HbF、HbH、HbE含量增加时，G6PD缺陷和α珠蛋白生成障碍性贫血者，结果均偏高。7.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测原理尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间结构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚单位，通过聚丙烯酰铵凝胶电泳可分离出各肽链区带。参考值正常血红蛋白HbA裂解后出现β、HbA、HbA2、和α四条带。临床评价本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，表示有异常血红蛋白存在。对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值。8.血红蛋白基因PCR技术检测原理一般PCR产物用DNA印迹法、酶切法或直接测序等方法进行检测。可检测出异常血红蛋白基因的存在，是纯合子还是杂合子，基因缺陷的部位等。临床评价在分子水平上进行血红蛋白病的诊断和研究。（七）陈发性血红蛋白尿症的检验酸化血清溶血试验蔗糖溶血试验蛇毒因子溶血试验1.酸化血清溶血试验

acidified-serumhemolysistest原理阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxymalnocturnalhemoglobinuriaPNH）患者体内存在对补体敏感的红细胞。酸化血清溶血试验也称Hamtest，即红细胞在酸性（pH6.4-6.5）的正常血清中孵育,补体被激活，PNH红细胞破坏而产生溶血。而正常红细胞不被溶解，无溶血现象。参考值正常人阴性临床评价本试验阳性主要见于PNH，特异性强，是诊断PNH最基本简易的确诊试验。但敏感性较差，30%患者呈阴性。某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性。注意事项

（1）血清酸化后，试管必须塞紧，否则二氧化碳逸出，酸度下降；

（2）抗凝剂会影响PH值，最好用脱纤维血；

（3）最好用混和血清，对照必须用O型血；

（4）患者多次输血会影响结果。（5）球形红细胞在酸化血清内呈假阳性反应，遗传性球形红细胞增多症者，在加热灭活补体后的血清中再作试验，仍呈阳性反应。2.蔗糖溶血试验

sucrosehemolysistest原理蔗糖溶血试验是根据PNH患者的红细胞，在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育，补体与红细胞膜结合加强，蔗糖溶液进入红细胞内，导致渗透性溶血而设计的。参考值定性试验：正常为阴性；定量试验：正常溶血率<5％临床评价PNH患者蔗糖溶血试验为阳性或溶血率增加，可作为PNH的筛选试验。自身免疫性溶血性贫血有的可为阳性，白血病、骨髓硬化时可出现假阳性。附注（1）所用仪器应清洁干燥（2）若无蔗糖可用葡萄糖代替。3.蛇毒因子溶血试验

venomhemolysistest原理蛇毒因子溶血试验多采用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子（C3b)可通过旁路途径激活补体，PNH患者的红细胞补体系统激活后，促使PNH补体敏感细胞破坏、溶血。参考值正常人溶血率<5％临床评价溶血率增加，PNH的可能性大，可反应PNHⅢ型红细胞的溶血情况。正常红细胞、PNHⅡ型等的红细胞均不发生溶血。4.血细胞表型CD59/CD55流式细胞术分析原理PNH是一种获得性造血干细胞基因突变引起血细胞膜缺陷所致的溶血病。其异常血细胞膜上的糖化肌醇磷脂-锚（GPI-anchor)连接蛋白如反应性溶血膜抑制物（CD59）和（或）衰变加速因子（CD55）等表达明显降低或缺乏。用GPI连接蛋白如CD59/CD55荧光标记的单克隆抗体作分子探针，用流式细胞技术分析红细胞膜上的CD59/CD55分子的表达量，对PNH诊断和鉴别诊断有重要的临床意义。参考值CD59（或CD55）阴性的红细胞>5%CD59（或CD55）阴性的中性粒细胞>10%

作为PNH诊断的临界值。非PNH患者和健康人均<5%。PNH患者CD59（或CD55）阴性的红细胞>9%，多数患者>20%；CD59（或CD55）阴性的中性粒细胞>16%临床意义患者CD59（或CD55）低表达的异常细胞群增多，支持PNH诊断。

本试验是目前诊断PNH特异性和敏感性最高的、可定量的检测方法。为PNH确诊试验。（七）免疫性溶血性贫血的检验抗人球蛋白试验冷凝集素试验冷热溶血试验1.抗人球蛋白试验coombs

试验原理检测自身免疫性溶血的自身抗体（IgG）检测红细胞表面有无不完全抗体的直接抗人球蛋白试验检测血清中有无不完全抗体的间接抗人球蛋白试验直接试验应用抗人球蛋白试剂（抗IgG

和/或抗C3d）与红细胞表面的IgG分子结合，如红细胞表面存在自身抗体，出现凝集反应。间接试验应用Rh（D）阳性O