微生物检验理论课 19弧菌科、苛养菌和螺杆菌、人共患病原菌检验 学习资料

弧菌属

（Vibrio

）南方医院检验系陈晶

2017-04-12Tel:61642145概述弧菌属是一群氧化酶阳性、具有端极鞭毛、动力阳性的革兰阴性细菌，其形态弯曲呈逗点状广泛分布于自然界，尤以水中为多，有36个种。主要致病菌为霍乱弧菌和副溶血性弧菌（致病性嗜盐菌）；前者引起霍乱，后者引起食物中毒主要内容霍乱弧菌的形态学特点和培养条件霍乱弧菌的血清学分群以及生物学分型霍乱的实验室诊断方法霍乱弧菌（V.cholera

）人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老却流行广泛的烈性传染病。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病《中华人民共和国传染病防治法》规定为甲类传染病：鼠疫、霍乱霍乱的流行史1917-1923共6次印度恒河三角洲古典生物型1961第7次

印度尼西亚

Eltor1992.10马德拉斯、孟加拉湾O139

1992年发现一个引起霍乱流行的新血清型菌株（O139），它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与O1古典型霍乱完全相同，但不能被O1群霍乱弧菌诊断血清所凝集。该菌株在水中的存活时间较O1群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株霍乱弧菌血清分群：

古典生物型（Classicalbiotype）

O1群霍乱弧菌

埃尔托生物型（El-Torbiotype）

O139群霍乱弧菌（新增）

非O1群霍乱弧菌生物学性状革兰阴性菌，弯曲呈弧形或逗点状菌体一端有单鞭毛和菌毛，运动活泼；活菌悬滴法直接镜检可见大量弧菌首尾相接排列呈鱼群状游动，穿梭或流星状O139群有荚膜图注：霍乱弧菌的鞭毛（↑）和它可溶解的鞘膜（↑↑）负染，×3100

图注：分裂中的霍乱弧菌冰冻蚀刻，×70000

霍乱弧菌的鞭毛染色培养特性需氧或兼性厌氧菌营养要求不高，在小肠（低营养环境）可分离到强致病菌株，在普通琼脂平板也生长良好耐碱不耐酸，在pH8.8~9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长迅速。因其他细菌在这一pH条件不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基液体培养基里大量繁殖，可形成菌膜

常用的选择培养基为硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS），霍乱弧菌在其中可形成较大的菌落，因发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色霍乱弧菌在含亚碲酸钾的琼脂平板上将碲离子还原成原子态的碲，形成有灰褐色中心的菌落生化反应氧化酶阳性硝酸盐还原试验阳性生化反应粘丝试验StringTest0.5%去氧胆酸钠水与被检菌新鲜培养物混匀，制成菌悬液，1min内悬液由混变清，并变得粘稠，接种环挑取可形成拉丝。霍乱弧菌古典生物型及El-Tor型均为阳性生化反应霍乱红试验：

霍乱弧菌含色氨酸酶，分解色氨酸产生吲哚，同时霍乱弧菌能将硝酸盐还原成亚硝酸盐。在含硝酸盐的蛋白胨水中培养霍乱弧菌，两种产物生成亚硝酸吲哚，滴加浓硫酸即呈现蔷薇色，为霍乱红试验阳性霍乱弧菌两个生物型的鉴别性状古典型El-Tor型溶血（1%绵羊红细胞）－d血凝（2.5%鸡红细胞）－＋V-P试验－＋多粘菌素B敏感试验（50U/片）＋－噬菌体Ⅳ组裂解（106/ml）＋－噬菌体Ⅴ组裂解（106/ml）－＋＋９０％以上为阳性；－９０％以上为阴性；ｄ１０－８９％阳性抗原结构

O抗原：耐热（100℃2h），特异性高，具有型/群特异性，是分型/群的基础，为多糖物质H抗原：不耐热，特异性低，为弧菌属共同抗原，为蛋白质生物学性状(血清型：根据抗原分型)抵抗力古典生物型对外环境抵抗力较弱，El-Tor生物型抵抗力较强霍乱弧菌对热、干燥、日光、化学消毒剂和酸均很敏感，耐低温，耐碱性条件霍乱弧菌对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但El-Tor生物型对一定浓度的多粘菌素B及庆大霉素有耐药性致病性侵袭力：以鞭毛运动为主（动力）、菌毛的定植作用、粘液素酶霍乱肠毒素（choleraenterotoxinCT）本质是蛋白质，不耐热；对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素，具有很强的抗原性霍乱肠毒素1个A亚单位毒性单位A1肽链具有激活腺苷酸环化酶的酶活性A2肽链结合B亚单位、参与转位5个B亚单位结合单位特异地识别肠上皮细胞膜上的神经节苷脂GM1受体致病机理霍乱弧菌胃对酸敏感，很快被杀死肠胃酸降低或缺乏，菌体增多鞭毛、菌毛、粘液素酶绒毛上大量繁殖CT的B亚单位结合神经节苷脂GM1受体形成膜通道A1肽链进入细胞ATPcAMP↑

促使肠粘膜上皮细胞分泌亢进肠液大量分泌大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻大量脱水和失盐，电解质紊乱发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡激活腺苷酸环化酶系统致病机理所致疾病烈性肠道传染病即霍乱，为我国的法定传染病（甲类），表现为剧烈的上吐下泻，导致严重的脱水、酸中毒、痉挛、尿闭、休克和死亡传播途径：污染的水源或饮食物经口传染患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”，并含大量弧菌，此为本病典型的特征临床分期临床意义1、前驱期：无明显前驱症状，或轻度腹鸣、腹胀和不适临床分期临床意义2、吐泻期：持续2～3天，因剧烈吐泻造成大量水分和电解质丧失临床分期临床意义3、脱水虚脱期：脱水貌，洗衣工手；循环衰竭、代谢中毒急性肾衰；水电解质平衡紊乱导致肌肉痉挛4、恢复期：各种症状趋于缓解，但可出现发热免疫性患过霍乱的人可获得牢固的免疫力，再感染者少见病后小肠内可出现分泌型IgA微生物学检查

标本采集标本以粪便为主，也可采取呕吐物和尸体肠内容物作检材尽量在用药前采集专人专送不可及时接种时，应插入碱性蛋白胨水中保存微生物学检查检验方法及鉴定直接镜检：涂片染色见革兰氏阴性，并成鱼群状排列的弧菌动力和制动试验：采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力的细菌微生物学检查

制动试验：制作同样一份标本，加入霍乱多价诊断血清（效价1：64），用暗视野镜观察，3分钟内最初活泼的运动被抑制，即为阳性此法优点是快速而特异，操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出微生物学检查快速诊断免疫荧光菌球法：将标本接种于含有霍乱弧菌荧光抗体的碱性蛋白胨水中，经37℃4-6h，如有霍乱弧菌，在荧光显微镜下可见发荧光的菌球。本法适用于大量标本的初筛SPA协同凝集试验：以霍乱弧菌IgG型抗体与SPA结合作为试剂，与米泔水样便或增菌液作玻片凝集，立即出现明显凝集者（＋＋＋）为阳性微生物学检查细菌分离培养弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离微生物学检查鉴定玻片凝集试验：从分离培养基上挑取可疑菌落于霍乱弧菌多价诊断血清（效价1:32-1:64）作玻片凝集试验。立即出现凝集者为阳性，同时设生理盐水和阳性细菌株对照形态学检查：取纯培养物涂片革兰氏染色，观察菌体形态及染色性。用悬滴法或半固体穿刺法检测动力微生物学检查生化反应：霍乱弧菌氧化酶试验、吲哚试验、粘丝试验和霍乱红试验均阳性多粘菌素B敏感试验：取被检菌2-3h肉汤培养物点种到含药营养琼脂平板上（多粘菌素B50U／ml）,37℃培养24h，El-Tor生物型不敏感，长出均匀的菌苔，而古典生物型敏感，不生长鸡红细胞凝集试验：在玻片上滴加生理盐水一滴，取被检菌18-24h培养物少许在盐水中制成浓厚菌悬液，然后加一滴2.5％新鲜鸡红细胞悬液，充分混匀，1min内出现凝集者为阳性，红细胞呈均匀分散者为阴性；El-Tor生物型为阳性，古典型为阴性鉴定流程思考题霍乱弧菌的血清学分群以及生物学分型？霍乱弧菌的形态学特点和培养条件？霍乱弧菌的实验室诊断方法?动力试验和制动试验？

弯曲菌属（Campylobacter）概述弯曲菌是一类菌体弯曲呈逗点状、S型或螺旋状、有动力的革兰氏阴性菌。微需氧、不分解糖类、氧化酶阳性、触酶阳性弯曲菌原属于弧菌属，1973年由弧菌属分出，命名为弯曲菌属对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种，前者是人类腹泻最常见的病原菌之一，后者主要引起肠外感染，在免疫功能低下时可致败血症、脑膜炎、心内膜炎等主要内容弯曲菌属的形态学特点和培养条件弯曲菌属的实验室诊断方法生物学性状形态与染色：革兰阴性弯曲或弧形，有荚膜，不形成芽胞；菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇图注：空肠弯曲菌的两端单鞭毛（↑）负染，×21000

生物学性状培养特性微需氧菌：5%O2+10%CO2+85%N2为最佳气体环境，在正常大气或无氧环境中均不生长最适温度37-42℃营养要求高，培养基需加入血液才能生长在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象生物学性状生化反应空肠弯曲菌生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素，不液化明胶，靛基质阴性可还原硝酸盐，氧化酶和过氧化氢酶阳性甲基红和VP试验阴性枸椽酸盐培养基中不生长生物学性状抵抗力较弱，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56℃5分钟可被杀死对多种抗生素敏感。但近年发现不少耐药菌株生物学性状致病性与免疫性空肠弯曲菌：致腹泻，也可引起交叉免疫反应致神经根受染，即格林-巴利综合征胎儿弯曲菌：致肠道外感染，其致病因素与肠毒素、内毒素、细胞毒素、侵袭力有关；感染后能产生特异性血清抗体微生物学诊断标本采集

取腹泻病人新鲜粪便或肛拭子立即送检。如不能及时送检，应将标本接种于卡－布运送培养基微生物学诊断直接涂片、镜检寻找革兰阴性，逗点状、S形或螺旋状小杆菌。或制悬滴标本在显微镜下观察有无投镖式或螺旋状运动的细菌分离培养接种于高度选择性培养基（布氏菌血琼脂抗性分离培养基），置于玻璃缸内微需氧环境，于42℃孵箱内培养48小时鉴定流程

螺杆菌属（Helicobacter）概述螺杆菌属是从弯曲菌属中划分出来的新菌属是一类氧化酶和过氧化氢酶阳性、微需氧、在37℃能够生长，在25℃和42℃均不能生长的革兰氏阴性螺形杆菌与人类关系最为密切的是幽门螺杆菌主要内容幽门螺杆菌的形态学特点和培养条件幽门螺杆菌的实验室诊断方法幽门螺杆菌重要的致病因子及其作用幽门螺杆菌（H.pylori）

幽门螺杆菌是一种定植于胃内的G-、螺杆状、微需氧菌，目前全球近50%的人口感染Hp。Hp感染呈慢性趋势，与胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤、胃癌等多种疾病相关。已被世界卫生组织列为一类致癌因子生物学性状形态染色革兰阴性，螺旋型弯曲，S形或海鸥形。在胃粘膜上皮细胞表面典型生长，在固体培养基上也可出现杆状或圆球形菌体一端或两端多鞭毛，末端钝圆、动力阳性生物学性状培养特性微需氧条件：5%O2+10%CO2+85%N2环境中生长良好37℃生长，25℃及42℃均不生长湿度要求高，以相对湿度98%以上为佳营养要求高，需加血液和多种物质方能生长；生长缓慢，故常在培养基中加抗生素抑制杂菌生长生物学性状生化反应氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性尿素酶强阳性：是Hp的一个非常重要的酶。它能使尿素分解成二氧化碳与氨。Hp在固体培养基上和胃粘膜上能产生大量尿素酶，其活性比其他微生物产生的尿素酶活性高几倍到几十倍。故尿素酶的测定可以作为Hp的快速诊断方法之一生物学性状致病因子可能的作用螺旋形菌体结构有利通过胃粘液层端鞭毛的运动加速穿透粘液层，与胃上皮细胞接触粘液素酶降解糖蛋白、有利Hp穿透粘液层尿素酶降解尿素产生“氨云”，中和菌体周围胃酸，有利Hp定植，并对上皮细胞有毒性作用Hp可能的致病因子及作用致病因子可能的作用粘附素使Hp定居胃上皮细胞表面热休克蛋白应激时保护蛋白完整ATP酶抑制H+泵，减少H+扩散脂酶和磷脂酶A消化粘液层，破坏上皮细胞膜过氧化氢酶在胃粘膜上起抗氧化作用，减少对Hp的毒性Hp可能的致病因子及作用（续）致病因子可能的作用空泡毒素VacA诱导细胞发生空泡变性，致上皮细胞损伤和溃疡形成细胞毒素相关蛋白CagA诱导上皮细胞产生多种炎性介质，吸引炎症细胞，释放酶类，导致胃组织损伤胃酸分泌物抑制因子抑制胃酸分泌，并促使急性炎症发生脂多糖能抑制上皮细胞膜基质的合成Hp可能的致病因子及作用（续）微生物学诊断组织切片染色镜检：将胃活检组织标本切片用Giemsa染色、苏木素-伊红染色或Warthin-Starry镀银染色可见到菌体，另用绞碎组织印片作Gram染色可发现菌体微生物学诊断快速尿素酶试验：尿素酶试剂由尿素、基质、酚红指示剂组成。将小块活组织放入尿素肉汤培养基，如培养基由黄变红色则为阳性。尿素试验可在15分钟内出现阳性，但是阴性报告要在24小时后发出微生物学诊断分离培养接种方法：标本粘膜面在培养基反复涂擦或将研碎组织匀浆接种培养基：巧克力培养基、脑心浸液培养基(BHI)、加有马血或羊血的布鲁氏琼脂培养基培养条件：在微需氧环境和98%以上湿度环境培养，注意严格无菌操作微生物学诊断13C或14C标记尿素呼气试验病人禁食一夜，进食用13C或14C标记的尿素，Hp产生的尿素酶分解尿素产生CO2，因此可测定病人呼气中释放的带同位素的CO2含量，如超过标准，则提示Hp存在该法特异性与敏感性均很好，且对病人无创伤，但需要特殊的同位素测定仪，并具有放射性危害苛养菌概述对营养要求及生长环境要求较为苛刻，普通培养条件下不生长或难以生长的一类细菌主要包括嗜血杆菌属、鲍特菌属及军团菌属；临床上常见种类有嗜血杆菌属主要内容嗜血杆菌属的形态学特点和培养条件嗜血杆菌属的实验室诊断方法百日咳鲍特菌的形态学特点和培养条件百日咳鲍特菌的实验室诊断方法嗜血杆菌属

(Haemophilus)归属巴斯德菌科与临床有关的9种：流感～、副流感～、溶血～、副溶血～、杜克雷～、埃及～、嗜沫～、副嗜沫～、迟缓～生物学性状形态与染色G-短小球杆菌，无芽孢、无鞭毛、多数有荚膜在陈旧培养物中荚膜可消失，呈长杆状、丝状等多形态生物学性状培养特性需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃生长发育需特殊营养物质X或（和）V因子

X因子：是对热稳定物质，存在于血红蛋白中的一种血红素及其衍生物，为含铁的卟啉

V因子：对热不稳定的维生素B类物质，存在于血液及某些植物组织中，是脱氢酶的辅酶巧克力平板上，光滑、湿润、露滴状流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌微生物学诊断标本采集脑脊液、血液、痰液、生殖道分泌物保持湿润，及时送检微生物学诊断直接镜检G-小杆菌或多形态杆菌脑脊液标本发现可疑菌时可同时做荚膜肿胀试验，进行快速鉴定微生物学诊断培养:巧克力培养基卫星现象（satellitephenomenon）

流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌共培养时，靠近葡萄球菌菌落的菌落大，远离的小微生物学诊断生化反应糖发酵不稳定、能还原亚硝酸盐根据吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶试验分为8个生物型根据荚膜多糖抗原分为六个血清型，b型致病性最强微生物学诊断抗原构造

型特异性荚膜多糖抗原（M抗原）：荚膜肿胀试验型特异性菌体抗原（S抗原）种特异性菌体抗原（R抗原）微生物学诊断抵抗力较弱，56℃30min，对消毒剂敏感微生物学诊断致病物质荚膜菌毛内毒素

IgA蛋白酶微生物学诊断所致疾病继发性（内源性）感染:常继发于流行性感冒、麻疹、百日咳、结核病等；临床类型有慢性支气管炎、中耳炎、鼻窦炎等原发性（外源性）感染：急性化脓性感染（脑膜炎、鼻咽炎等）血液脑脊液浓汁痰分离培养（巧克力平板）涂片、镜检、荚膜肿胀试验标记抗体DNA探针杂交报告结果涂片、荚膜肿胀试验菌落形态、卫星现象、血清学试验鉴定流程微生物学诊断药敏试验

K-B法，但应选用HTM专用培养基常规需检测β-内酰胺酶，阳性提示对青霉素等β-类酰胺抗生素耐药耐药性一般来自耐药质粒和染色体突变鲍特菌属

(Bordetella)分类:百日咳～、副百日咳～、支气管、鸟～、欣氏～、霍氏～前三种DNA同源性较高，是临床上的常见致病菌生物学性状形态与染色革兰阴性短小杆菌，两端浓染无芽胞，无鞭毛，光滑性有荚膜生物学性状培养特性营养要求很高,专性需氧鲍－金（Bordet-Gengou）培养基：马铃薯、甘油、血液

菌落：细小、光滑、隆起、珠光色泽、溶血环

Ⅰ相菌→Ⅱ、Ⅲ相→Ⅳ相（S型）（R型）生物学性状生化反应触酶阳性不发酵糖类生物学性状致病性与免疫性不侵入血流致病物质：荚膜、菌毛、内毒素及多种生物活性物质，百日咳毒素、血凝素、皮肤坏死毒素等生物学性状所致疾病-百日咳传染源：早期病人和带菌者病程分三期：卡他期传染性强痉挛期阵发性剧咳恢复期免疫力：局部粘膜免疫，持久

（白百破三联疫苗）微生物学诊断标本采集发病早期采集呼吸道分泌物鼻咽拭子法咳碟法微生物学诊断直接镜检直接革兰染色镜检阳性率低，仅作参考微生物学诊断培养特性百日咳鲍特菌在血培养基和巧克力培养基上不生长鲍-金培养基生长缓慢，需2-3天出现菌落至少培养7天无生长才可报阴性结果标本（咳碟法、鼻咽拭子）直接检查（G氏染色）DFA（荧光抗体法）PCR分离培养血清学诊断，ELISA等可疑菌落（细小、光滑、灰色不透明）菌落观察镜检生化反应DFA、核酸检测凝集试验（鲍-金氏培养基）鉴定流程微生物学诊断药敏试验一般不必进行常规耐药性监测红霉素首选对青霉素耐药人兽共患病原菌感染动物，也能感染人类直接接触、媒介动物叮咬等传播途径,有病毒、细菌、螺旋体、立克次体等人兽共患菌包括：炭疽芽胞杆菌（需氧G+杆菌）鼠疫耶尔森菌(肠杆菌科)布鲁菌属巴斯德菌属弗朗西斯菌属鼠疫plague炭疽病anthrax主要内容布鲁菌属的形态学特点和培养条件布鲁菌属的实验室诊断方法弗朗西丝菌属的形态学特点和培养条件弗朗西丝菌属的实验室诊断方法布鲁菌属

(Brucella)

1886年，英国Bruce首次从死者尸体脾脏中分离到，当时命名为马耳他细球菌1887年，Bong在病牛的流产物中分离到病原体，称为牛流产杆菌1920年，Meyer倡议将这些类似的病原体称为布鲁菌属侵袭力强，胞内寄生菌分类

牛布鲁菌（B.abortus）羊布鲁杆菌（B.melitensis）猪布鲁杆菌（B.suis）犬布鲁杆菌（B.canis)等生物学特性形态与染色革兰阴性小球杆菌或短杆菌两端钝圆无动力、无芽孢、无荚膜生物学特性培养