微生物检验理论课 10侵袭性真菌病检测现状和进展 学习资料

侵袭性真菌病南方医科大学第二临床医学院龙军

学习要求掌握：1、引起侵袭性真菌感染真菌包括哪些？高危人群？2、常见侵袭性真菌的生物学性状及常规检测技术？3、侵袭性真菌感染快速检测技术？主要了解：真菌抗菌药物有哪些？如何选择？目录一、全球真菌感染流行病学及危险因素二、常见真菌的生物学性状及常规检测二、IFD非培养检测技术四、真菌药敏实验五、病例分享全球真菌感染现状一、两高两低：高感染率、高死亡率

低诊断率、低治疗率每年有10亿人受真菌感染性疾病影响3.1亿人受真菌感染1150万人受致死性真菌感染，超过150万感染患者死亡

例如：全球有35万念珠菌血症病例，全球念珠菌感染数为92.1万印度ICU的多中心研究约有67.5万念珠菌病患者仅有少量针对真菌感染的疾病研究全球真菌感染人数至少被低估2倍以上，而在中国可能更多。侵袭性真菌病（invasivefungaldisease，IFD）即以往所说的深部真菌病，是指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病。据WHO统计，能引起人类疾病的真菌约有270余种，尤其是深部真菌，可侵袭心、肺、血液、胃肠等人体各个器官和系统。真菌感染已成为临床感染学中不可忽略的一部分侵袭性真菌病侵袭性真菌病

深部感染真菌多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变主要真菌：假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛霉、组织胞浆菌和卡氏肺胞菌常见受累部位念珠菌主要侵犯黏膜(呼吸道、消化道、泌尿道)，进一步扩散至血液，从而引起播散性感染；隐球菌引发脑膜炎、脑膜脑炎等；曲霉菌的感染一般初期多为肺部感染，以后播散中枢神经系统以至全身；毛霉菌侵犯脑、眼、肺、心血管造成损害-组织坏死-脱落后出血，病程最为凶险致病性真菌：在正常人体内不存在，一旦侵入机体，即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等，属外源性，临床少见条件致病性真菌：为人体正常菌群的成员，当机体抵抗力下降时才致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌、毛霉菌和卡氏肺孢菌等侵袭性真菌分类侵袭性真菌感染的危险因素患有基础疾病如肺结核、恶性肿瘤、糖尿病、营养不良、烧伤、爱滋病等长期大量联合使用广谱抗生素服用肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、经放射性治疗或化学治疗后、器官移植后等住院时间长,尤其是入住ICU>5天以上静脉插管及各种侵袭性操作高龄(>65岁)、婴幼儿1.高危患者无明显诱因出现新的发热（体温正常或已下降）或持续性发热伴白细胞增多者。2.对高危病人同时在两个部位，两次以上找到真菌，排除污染，即使患者无明显的发热等症状，也要考虑有侵袭性真菌感染。3.对于发热的患者，肝功能明显异常，且逐渐加重，甚至出现原因不明的肝功能衰竭，排除病毒感染和药物等因素所致肝功能异常时要考虑侵袭性真菌感染。4.大剂量糖皮质激素治疗或长期口服糖皮质激素治疗的发热患者，给予广谱抗生素治疗仍然发热，要高度怀疑侵袭性真菌感染，进一步寻找真菌感染的证据，如痰、大小便、血液等。侵袭性真菌感染的临床证据

5.对于干咳，肺部X线或CT检查发现不典型的肺部阴影，临床不支持结核和非典型病原体感染时，要考虑真菌感染。6.对于中性粒细胞减少或缺乏的高危患者，一旦发热，抗生素治疗无效即要警惕真菌感染。7.对于发热患者，如果出现视力异常时，经眼科检查拟诊为内眼炎时，要考虑有真菌感染。文献表明内眼炎占念珠菌血症的9%-15%。8.慢性脑膜炎正规抗结核治疗失败者应警惕隐球菌脑膜炎的可能，需做脑脊液墨汁染色找隐球菌及其抗原检测真菌感染流行病学变迁中国2010《念珠菌病诊断与治疗：专家共识》全球ARTEMIS研究:白念珠菌在念珠菌属中所占比率自70.9％降至62.9~65.0％，而非白念珠菌略有上升中国5所医院ARTEMIS研究:白念珠菌占念珠菌属分离菌的61.5%在ICU念珠菌血症患者中，白念珠菌仅占40%，近平滑念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌各占23%、15%和9%另一来自免疫缺陷者念珠菌血流感染的报道中非白念珠菌占54%仍以白念珠菌为主非白念珠菌、曲霉等其它真菌的检出率逐年增加新型致病真菌或是耐药菌的出现院内真菌感染的病原体以念珠菌居多，各临床科室发病率有所不同PfallerMAetal.CritRevMicrobiol.

2010;36(1):1-53.普通病房血液恶性肿瘤骨髓移植HIV新生儿监护病房实体器官移植实体肿瘤外科(非移植)合计(n=3,640)(n=1,010)(n=377)(n=263)(n=54)(n=886)(n=863)(n=1,906)(n=6031)念珠菌属81.742.631.632.796.357.289.291.275隐球菌属4.02.10.048.70.06.41.61.04.5其它酵母菌*1.23.32.73.40.01.01.20.81.4曲霉菌属8.333.850.74.91.926.04.93.412.3接合菌1.15.26.41.11.91.70.00.61.4其它霉菌*1.67.66.41.50.04.71.31.52.7地方性真菌1.91.20.51.60.02.60.80.71.62004-2008年间美国IFD病原体在各临床科室的分布(%)*其它酵母包括6例马拉色菌属，26例肺孢子菌，12例红酵母，21例啤酒酵母和6例毛孢子菌*其它霉菌包括2例支顶孢菌,9例交链孢霉,3例双极孢菌，53例镰刀霉，10例拟青霉菌,13例赛多孢子菌，6例足分枝霉菌和1例白色簇孢霉

不同科室的IFD情况不尽相同不同部位真菌感染流行病学存在差别呼吸系统其它部位骨关节、心血管系统等以念珠菌最为常见腹腔感染以念珠菌最为常见真菌血流感染泌尿系统中枢神经系统以隐球菌多见念珠菌，曲霉菌少见常见病原体为曲霉菌以念珠菌最为常见以念珠菌尿最为多见侵袭性真菌感染重点科室：血液科，呼吸科，ICU科，肿瘤科，移植科室等侵袭性真菌感染预后感染类型病死率侵袭性念珠菌病10-49%侵袭性曲霉病62-85%粒细胞缺乏患者曲霉感染>90%镰刀菌属感染79-87%播散性接合菌病96%常见侵袭性真菌的生物学性状及检测假丝酵母菌（Candida）属假丝酵母菌俗称念珠菌，本属菌有150个种，11种对人有致病性,白假丝酵母菌为最常见的致病菌白假丝酵母菌(Saccharomycesalbicans)亦称白色念珠菌(Candidaalbicans)，存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病。为假丝酵母菌属中最常见的条件致病菌，可引起皮肤、黏膜和深部组织器官的内源性感染。形态：圆形或卵圆形单细胞真菌，直径3~6μm，革兰阳性培养：普通琼脂、血琼脂与沙保培养基,需氧。室温或37℃甚至42℃生长良好菌落灰白色或奶油色，表面光滑，带有浓厚的酵母气味。有大量向下生长的营养假菌丝，呈类酵母型。在玉米粉培养基上可长出假菌丝和厚膜孢子白色念珠菌生物学性状条件致病皮肤粘膜感染鹅口疮，阴道炎内脏感染：肺炎、关节炎、膀胱炎，肾盂肾炎中枢神经感染：脑膜（脑）炎、脑脓肿致病性1.泌尿道感染（UTI）是最常见的医院获得性感染之一；其中70%-80%由留置导尿管引起。CAUTI在儿科患者中的疾病负担尚未明确。2.成人医院的住院患者中有12%-16%在入院后的某些时间段需要使用导尿管。3.在留置导尿管期间，每日发生菌尿症的风险为3%-7%。4.由任意一次导尿所致的疾病发生率并不高，但住院期间频繁使用导尿管意味着CAUTI的累积风险较高。EvelynLo,LindsayE.Nicolle,SusanE.Cofn,CarolynGould,LisaL.Maragakis,JenniferMeddings,DavidA.Pegues,AnnMariePettis,SanjaySaintandDeborahS.Yokoe，InfectionControl，Volume35，Issue05，May2014,pp464-479菌血症的发生——需警惕尿路念珠菌播散至血的可能研究显示，约10%的念珠菌血症是尿路来源逆行感染引起的3年期间，61所魁北克医院报告，入院后48小时及以上明确的所有血流感染（BSI）中有21%源于泌尿道其中71%与医疗器械相关。泌尿道来源的BSI发生率为1.4/10,000患者-日。这些患者的30天全因死亡率为15%。医院内导尿管相关菌血症的研究显示由此导致的死亡率在9%至13%之间。菌血症的发生——需警惕尿路念珠菌播散至血的可能EvelynLo,LindsayE.Nicolle,SusanE.Cofn,CarolynGould,LisaL.Maragakis,JenniferMeddings,DavidA.Pegues,AnnMariePettis,SanjaySaintandDeborahS.Yokoe，InfectionControl，Volume35，Issue05，May2014,pp464-479糖尿病、女性、高龄、肾功能不全的ICU患者需警惕念珠菌菌尿症FisherJF,etal.ClinInfectDis.2011May;52Suppl6:S457-66.糖尿病肾移植高龄泌尿系统的规范女性伴细菌尿延长住院期泌尿道先天畸形入住ICU泌尿道结构异常使用广谱抗生素留置导尿管膀胱功能障碍尿停滞肾结石危重患者，由于肾脏在80%患者中是念珠菌血症的目标，因此对于念珠菌尿症，无论是否有症状，应该首先被视为有先兆的播散性念珠菌病。的确，尿中酵母菌的发现可能是该患者具有威胁生命的感染的唯一线索。由此可见，一个精明的医师对于这样的病人将立即考虑播散性念珠菌病并检查光学眼底，皮肤和血管通路装置及获得真菌血培养。高危人群—易感泌尿系统感染的相关人群导尿管相关尿路感染继发血流感染的机制在一般情况下，泌尿系统有一定的防御能力1。当泌尿系统插入导管后，导管本身可损害许多正常的防御机制：1.NealJrDE.Hostdefensemechanismsinurinarytractinfections.UrolClinNorthAm.1999,26(4):677-6862.NickelJ,CostertonJ,McleanR.etal.Bacterialbiofilms:influenceonthepathogenesis,diagnosisandtreatmentofurinarytractinfections.JAmtimicrobialChemother1994;33SupplA:31-413.WarrenJ.Catheter-associatedurinarytractinfections.InfectDisClinNorthAm1997;11(3):609-6224.WarrenJ.Catheter-associatedurinarytractinfections.IntJantimicrobAgents2001;17(4):299-3035.KurosakaY,IshidaY,YamamuraE,etal.Anon-surgicalratmodelofforeignbody-associatedurinarytractinfetionwithPseudomonasaeruginosa.MicrobiolImmunol2001;45(1):9-15可使正常情况下相对无菌的膀胱内环境与外环境相通，微生物可沿着导管的内外表面上行3；在导尿的状态下，通常有尿液在膀胱或导管内存留，这有利于细菌的增殖4；如果导管发生阻塞，引起膀胱过度膨胀，可使膀胱黏膜损伤和缺血，有利于细菌入侵；导管本身也可通过机械性地破坏和激发炎症反应损伤膀胱黏膜2,5。尿道、膀胱粘膜屏障破坏尿道粘膜屏障破坏后会导致泌尿系感染泌尿系感染诊断治疗指南.新生隐球菌（CryptococcusNeoformans）

新生隐球菌广泛分布于自然界，也可存在于人体体表、口腔及肠道中；传染源是鸽子经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜；此外可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者；临床上怀疑脑膜炎时，常抽取脑脊液检查抗酸菌、隐球菌；生物学特性

圆形，4-6um,有肥厚荚膜（大，可比菌体大1-3倍）折光性强，一般染料不易着色染色：墨汁负染出芽繁殖，不形成假菌丝（酵母型菌落）培养特性:沙保培养基上，室温、37℃2～3天即可长出典型酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠;非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别曲霉菌（Aspergillus）菌曲霉菌（Aspergillus）引起食物、药品霉变的常见污染菌,为条件致病菌侵犯机体多部位，最多见呼吸系统直接感染、变态反应、真菌毒素烟曲霉菌落烟曲霉,光镜X400黄曲霉菌落黄曲霉,光镜X200

黑曲霉菌落黑曲霉,光镜X200组织胞浆菌属有两个种：荚膜组织胞浆菌、组织胞浆菌的杜波变种。本菌传染性极大，主要侵犯网状内皮系统，有时也可由血行播散而侵犯全身各脏器。组织胞浆菌是一种双相型真菌，在25℃培养时呈典型菌丝体，在37℃培养时为酵母型，位于细胞内或外。微生物检验1.直接显微镜检查应涂片染色后检查。痰液等标本：涂片后先用甲醇固定10min，再用姬姆萨染色镜检。皮损、脓液等标本：用20%KOH涂片后镜检2.抗原检测、药物敏感试验、抗体检测3.分离培养与鉴定①标本含抗生素的沙氏培养基25℃培养，生长缓慢，有时需4~6周才开始生长，逐渐形成白色至棕色绒毛状菌落。

②转种于血琼脂培养基上，37℃培养，很快形成酵母型菌落。③培养物显微镜特征：25℃沙氏培养，可以发现特征性的大分生孢子，但初代培养不典型，继代培养可有典型大分生孢子。④鉴定：取可疑菌落涂片染色镜检，并作脲酶试验和明胶液化试验。荚膜组织胞浆菌菌落为棉絮状，镜检可见细长有隔菌丝，菌丝侧面或孢子柄上长有特殊的圆形大分生孢子，厚壁，四周有棘突，排列如齿轮。血液标本油镜下镜检可见在中性粒细胞或单核细胞中有卵圆形或圆形的酵母细胞卡氏肺孢菌卡氏肺孢菌（pneumocycsiscarinii,PC），曾称为卡氏肺孢子虫。卡氏肺孢菌可寄生于多种动物，也可寄生于健康人体。广泛分布于自然界，如土壤和水等。卡氏肺孢菌病的传播途径主要是空气传播，在健康人体内，多为无症状的隐性感染。当宿主免疫力下降，如长期使用免疫抑制剂、器官移植、肿瘤、艾滋病等，潜伏的卡氏肺孢菌在病人肺内大量繁殖扩散，使肺泡上皮细胞受损，导致间质性浆细胞肺炎，又称卡氏肺孢菌性肺炎（PCP）。卡氏肺孢菌微生物检验直接显微镜检查从病人痰液、支气管肺泡灌洗液或肺活检组织中检查PC是确诊本病的重要依据。常用的染色方法有姬姆萨染色、果氏环六亚甲基四胺银染色（GMS）和亚甲胺蓝染色。可以检出包囊和滋养体两种形态。抗原检测，核酸检测，抗体检测等。影像学检查非常重要。卡氏包囊卡氏包囊和滋养体毛霉目真菌毛霉目真菌属于接合菌门、接合菌纲，有7个科，主要是毛霉科。本病是一种发病急，进展快、病死率极高的系统性条件致病性真菌感染。毛霉目真菌有无隔菌丝，在一些陈旧培养基中偶见有隔菌丝。

真菌感染的标本采集与检验流程真菌感染的微生物学检查标本浅部感染：皮屑、毛发、指（趾）甲屑深部感染：痰、血液、脑脊液、分泌物1.皮肤及皮肤附属物：毛发、皮屑、指（趾）甲等。2.各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。3.血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。4.脓汁和渗出液微生物学检查标本采集送检注意事项早期采集：病程早期、急性期，使用抗菌药物前无菌采集：无菌操作，无菌容器根据目的菌特性用不同方法采集尽快运送采集好的标本；尽快接种或涂片标本。真菌的检验方法

镜检真菌形态真菌分离培养与鉴定真菌抗原检测真菌核酸检测抗体检测直接镜检1.不染色：如癣病取病发或病损部位皮屑、甲屑置于载玻片上+KOH（使角质软化）+盖玻片→镜检，找菌丝、孢子

2.染色：革兰氏染色、墨汁染色、瑞氏染色等

真菌标本直接检查

直接镜检的意义直接镜检阳性表示：①有诊断意义，如浅部真菌病等；②看到的就是真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种,如假丝酵母菌的厚膜孢子等；直接镜检的局限：①阴性结果不能排除真菌感染；其敏感性随标本类型、数量、采集时间和质量等而有所不同②有假阳性结果---溶解的淋巴细胞在脑脊液中易被误认为阳性。因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。是目前鉴定真菌的惟一方法。大多数真菌培养温度为28℃，有些深部真菌为35℃。对二相性真菌培养时,28℃培养真菌呈菌丝相（霉菌型），35℃培养为组织相（酵母型）。菌落观察：是鉴别真菌的方法。阳性检出率低。

分离培养50培养检查法直接镜检分离、培养、鉴定诊断阳性率高------BALF培养阳性率40%，涂片+培养67%鉴定试验芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，直37℃水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。TZC试验：将白色念珠菌接种于含0.005％氯化三本四氮唑的沙保培养基中，经22～25℃，24～48h培养.白色念珠菌不变色或仅淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。糖发酵和糖同化试验厚膜孢子形成试验动物实验

产色培养基IFD非培养检测技术——多糖生物标记物检测www.GAFFI.org真菌学实验室所需的核心诊断测试测试感染诊断灵敏度周转时间镜检侵袭性感染、皮肤、毛发和指甲、外阴阴道念珠菌病30-90%2小时抗原检测隐球菌脑膜炎99%2小时呼吸道样本的PCR肺孢子菌肺炎98%1天血清和呼吸道样本的抗原ELISA试验侵袭性曲霉菌病(组织胞浆菌病)80%2天葡聚糖检测大部分真菌感染，高阴性预测值(NPV)代表可以停止用药65-77%2天烟曲霉IgG抗体慢性肺曲霉病80-95%2天烟曲霉IgE抗体过敏性支气管肺曲菌病的哮喘筛查>95%2天真菌培养和鉴定所有除肺孢子菌肺炎以外10-50%3-14天组织病理学阳性、培养阴性样本的分子诊断所有，特别是霉菌感染50-60%7天伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑血液浓度曲霉菌病100%3天

一、隐球菌病隐球菌病

隐球菌病是由隐球菌引起的一种亚急性或慢性深部真菌病；隐球菌属已知有37个不同的种，但具致病性的多为新型隐球菌，它

的特点是菌体由一层很厚的多糖荚膜所包被。新型隐球菌有8个变种。在我国，隐球菌感染以非HIV患者为主1.KethireddyS,etal.DrugMetabToxicol.2007;3(4):573-81.2.BicanicT,etal.BrMedBull.2004;72:99-118.3.揭育胜等.广东医学.2008;29(6):888-891.较早发现艾滋病的地区，隐球菌的发病率约为5/10万在AIDS患者中感染率高达30%1,2国外隐脑发病以散发、非AIDS人群为主，起病常隐匿，表现为慢性或亚急性过程，初起症状多不明显，无特征性3新型隐球菌隐球菌病的主要类型皮肤黏膜隐球菌病肺隐球菌病

系统性隐球菌病该病所累及的器官主要是脑、肺和皮肤，且主要表现为脑一肺型和脑一皮肤型;在肺和皮肤出现隐球菌感染时，脑部的病变是其发展的必然结果，但各系统的症状、体征无特殊性

中枢神经系统隐球菌病分为脑膜炎型、脑膜脑炎型、肉芽肿型、囊肿型。该病的诊断相对较难,因为仅20%的患者有症状,且无明显体征，隐球菌抗原的检测具有决定性诊断意义，要注意医护人员隐性感染，血清抗原有时阴性。1.墨汁染色涂片：

适合于CSF及BAF,立即可报告，但阳性检出率不高2.脑脊液或血液培养：

培养及鉴定时间需4－5天，阳性检出率低，培养及鉴定时间长，易误诊3.抗原检测试验：

适合于CSF、血清及BAF样本，抗原检测的敏感性可达到90%以上，对CSF的特异性强，能实现早期快速诊断4.组织病理学检测和影像学检测

适合于肺组织等内脏器官，PAS染色有助于鉴别

常见隐球菌检测方法ELISA法的影响因素远少于乳胶凝集法HDEnglerandYRShea.Effectofpotentialinterferencefactorsonperformanceofenzymeimmunoassayandlatexagglutinationassayforcryptococcalantigen.J.Clin.Microbiol.1994,32(9):2307乳胶凝集法ELISA法假阳性因素血清含有类风湿因子标本中含有琼脂凝固剂、羟乙基淀粉血清3价Fe含量超过200mg/dl其他微生物感染，如嗜CO2菌属、丝孢酵母菌其他微生物感染，如毛孢子菌属HIV感染者非特异性凝集采用不适当的清洗剂洗涤试验用品，如反应玻片使用链霉蛋白酶治疗假阴性因素感染早期，荚膜抗原浓度太低感染早期，荚膜抗原浓度太低血清中含有免疫复合物血清中含有免疫复合物荚膜抗原浓度过高，出现后带现象菌株荚膜太少，分泌抗原含量低菌株荚膜太少，分泌抗原含量低二、1,3-β-D葡聚糖试验（G试验）G试验检测的特点1.高蕾，周新.(1,3)-β-D葡聚糖检测在侵袭性真菌感染中的诊断意义[J].中国感染与化疗杂志,2008,3

(2),123-125.2.J.Clin.Microbiol.2008.4(6):1009–1013.

可检测除隐球菌和接合菌外的多种真菌感染在浅部真菌感染中，1,3-β-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。因此可区分定植和感染。

G试验检测一般先于临床症状3-10天，是早期检测的重要手段[1]。对于念珠菌血症,G试验检测是首选检查方法[2]。

检测快速，可在2小时得出检测结果。G试验被列入真菌诊断和治疗的指南

欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)

美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组(MSG)批准用于真菌诊断(JAntimicrobialChemotherapy2008,61:S1,i3)。

中国血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(第3次修改版本)血清G试验连续2次阳性是侵袭性真菌感染临床诊断的指标G试验的假阳性因素应用纤维素膜进行血液透析患者，标本接触纱布或其他含有葡聚糖的材料操作者处理标本存在污染静脉输注白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白或血液制品某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）使用多糖类（香菇多糖、裂殖菌多糖）抗肿瘤类药物食用蘑菇类食物服用磺胺类药物、阿莫西林/克拉维酸、头孢类药物、多粘菌素、厄他培南也会引起不同程度的假阳性某些特殊疾病：系统性红斑狼疮和多发性骨髓瘤G试验的假阴性因素检测隐球菌和接合菌（犁头霉、毛霉、根霉）感染对于某些近平滑念珠菌感染的患者抗原-抗体免疫复合物形成抗真菌药的使用，如卡泊芬净，能非竞争抑制BG合成标本放置时间过长，待测物发生变化或降解（一般不超过6小时）局灶性真菌病，BG很少释放入血。三、半乳甘露聚糖抗原试验（GM）侵袭性曲霉病(InvasiveAspergillosis,IA

)

侵袭性曲霉病是指致病性曲霉菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。

曲霉是条件致病菌，当机体免疫力下降时，如：粒细胞缺乏或HIV感染，可侵犯肺、甚至全身各系统；呼吸系统曲霉病主要有三种，即过敏性、曲霉球（即继发性非侵袭性肺曲霉病）和肺炎型；曲霉引起的败血症在粒细胞缺乏患者中较常见。具有致病性的主要是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、灰绿曲霉和棒曲霉。其中烟曲霉菌是引起免疫抑制患者严重深部曲霉菌感染的最常见病原菌。中国大陆地区曲霉病流行现状分析结果曲霉感染的主要致病菌为烟曲霉菌1991年1月-2009年10月报道曲霉病1457例，其中481例有病原学证据，258例进行菌种鉴其中烟曲霉153例高露娟,等.中国真菌学杂志.2010;5(4):247-251GM实验-半乳甘露聚糖检测半乳甘露聚糖（galactomannan,GM)是曲霉细胞壁的特异性细胞壁多糖成分，可以作为血清曲霉特异性抗原。方法：乳胶凝集实验、ELISA样本：血液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、脑脊液等结果判定：连续两次阳性有诊断意义GM试验被列入真菌诊断和治疗的指南

欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)

美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组(MSG)批准用于真菌诊断(JAntimicrobialChemotherapy2008,61:S1,i3)。

中国血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(第3次修改版本)血清GM试验连续2次阳性是侵袭性真菌感染临床诊断的指标（1）使用了半合成青霉素，如哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸（2）与其他细菌或真菌成分有交叉反应（3）肠道中定植的曲霉释放GM进入血液（4）食物中存在GM（如大豆），通过受损肠粘膜进入血液（5）接受白蛋白、免疫球蛋白和其他营养液治疗（6）血液透析（7）接受心肺旁路手术（8）自身免疫性肝炎等免疫性疾病（9）新生儿和儿童（与双歧杆菌交叉反应）GM试验假阳性因素GM试验假阴性因素

1）抗真菌药物使用（如两性霉素B、三唑类药物），可抑制菌丝生长从而减少GM分泌。GM试验主要适用临床科室曲霉菌感染：血液科（白血病等）呼吸科（肺曲霉菌病）ICU科（危重症患者继发曲霉菌感染）肿瘤科（肿瘤患者继发曲霉菌感染）移植科室（移植术后继发曲霉菌感染）感染科（AIDS等）小结GM试验和G试验都能对临床常见的侵袭性真菌感染作出早期判断，G试验尤其能很好地将念珠菌的定植与感染区分开。GM实验和G实验联合用于诊断侵袭性曲霉病的特异度达100%，阳性预测值达100%。G试验不能检出接合菌和隐球菌，也不能鉴定具体菌属和菌种。GM试验只针对曲霉感染，对其它真菌检测无效，且敏感性和特异性受诸多因素影响。四、真菌抗体试验真菌抗体试验白色念珠菌IgG和IgM烟曲霉IgG、IgM、

IgE.联合检测的临床价值IFD联合检测诊断方案：IFD非培养联合检测技术念珠菌抗原抗体联合检测曲霉菌抗原抗体联合检测真菌检测

完整解决方案隐球菌感染+-检测GXM抗原怀疑新型隐球菌感染怀疑真菌感染/真菌易感人群怀疑曲霉菌感染怀疑念珠菌感染G试验检测Mn抗原-+念珠菌感染+-检测IgM/IgG抗体IgM+IgG-IgM-IgG+急性感染近期感染排除近期感染IgM-IgG-近期感染IgM+IgG+检测GM抗原G试验-++-曲霉菌感染IFD非培养联合检测技术的临床价值针对患者不同的病程，抗原、抗体的联合检测结果提高了检测的准确率抗原、抗体联合检测有助于防止漏检抗原、抗体的浓度变化能为临床调整用药方案提供参考依据侵袭性真菌病防治策略预防用药经验性治疗抢先治疗目标治疗感染病程高危患者拟诊临床诊断确诊1.监测真菌耐药趋势2.为临床选择敏感的抗真菌药物3.为合理用药提供快速有效的依据4.并有助于临床真菌感染的管理四、真菌药敏试验的临床意义多烯类：两性霉素B、制霉菌素（与麦角固醇结合）非多烯类：灰黄霉素唑类药物：

1.三唑类药物:氟康唑、伊曲康唑（抑制麦角固醇合成）2.咪唑类：酮康唑丙烯胺类:特比萘芬（抑制乙酰辅酶A）合成抗真菌药物:5-氟胞嘧啶（阻断核酸合成）新型抗真菌药物

1.第二代三唑类药物:伏立康唑、泊沙康唑2.棘白菌素类:卡泊芬净、米卡芬净（抑制葡聚糖合成）3.尼可霉素Z（抑制甲壳质合成）4.普拉米星和贝拉米星（抑制甘露聚糖蛋白）临床常用的抗真菌药物常用抗真菌药物的抗菌活性和抗菌谱Dobbs-AshieyES,etal.ClinInfectDis.2006;43（suppl1）真菌AmBa伏立康唑卡泊芬净曲霉菌+++黄曲霉±++烟曲霉+++黑曲霉+++土曲霉-++念珠菌+++白色念珠菌+++光滑念珠菌+++克柔念珠菌+++葡萄牙念珠菌-++近平滑念珠菌++±热带念珠菌+++新生隐球菌++-第44版热病指南---体外抗菌活性（念珠菌和隐球菌）TheSanfordGuildToAntimicrobialTherapy(44thEdition)微生物抗真菌药物伏立康唑卡泊芬净两性霉素B白色念珠菌+++++++++光滑念珠菌++++++热带念珠菌+++++++++近平滑念珠菌+++++(MIC高)+++克柔念珠菌+++++++季也蒙念珠菌+++++(MIC高)++葡萄牙念珠菌++++++新型隐球菌+++-+++

-无活性；±可能有活性；+有活性，作三线用药(至少临床有效)++有活性，二线用药(临床作用稍差)；+++有活性，一线用药(临床常常有效)对于白念及热带、近平滑这三种念珠菌，三种药物的抗菌活性都很优，而对于常见的光滑及克柔，卡泊芬净的抗菌活性最优，而隐球菌则以伏立康唑及两性霉素B的活性最优。第44版热病指南---体外抗菌活性（曲霉菌和其它真菌）珠江医院TheSanfordGuildToAntimicrobialTherapy(44thEdition)-无活性；±可能有活性；+有活性，作三线用药(至少临床有效)++有活性，二线用药(临床作用稍差)；+++有活性，一线用药(临床常常有效)微生物抗真菌药物伏立康唑卡泊芬净两性霉素B烟曲霉+++++++黄曲霉+++++++(MIC高)土曲霉+++++-镰刀菌属++-++(脂质剂型)足放线病菌：尖端赛多孢子菌+++±±足放线病菌：多育赛多孢子菌±-±接合菌纲(如毛霉/根霉)--+++(脂质剂型)在上述药物中，伏立康唑对曲霉菌拥有最强的体外抗菌活性，但对接合菌无效什么情况下需做体外药敏试验

建议在下列情况下：1、分离菌株来自血源性感染或其他无菌部位2、病原为非白念珠菌特别是光滑或克柔念珠菌或者其他霉菌3、抗真菌治疗疗效不佳4、拟采用唑类药物进行抗真菌治疗抗真菌药物体外敏感试验1.液体稀释法CLSIM27A2：致病性酵母菌CLSIM38A：产孢丝状真菌2.琼脂稀释法3.纸片扩散法——CLSIM44-ARoscoe纸片4.E－test法判读难点拖尾生长在唑类药物孔中的微弱生长(得分=1或2)导致对MIC值高估可能被误判为耐药Control例如:在如下所有氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑孔中都有拖尾生长12480.1250.250.50.060.1250.250.51632641281241248FCAITRVRCMIC1MIC0.125MIC0.06E-test方法可适合多种真菌的药敏测试，如念珠菌、隐球菌、曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等E-test检测曲霉MICE-test检测念株菌MIC

真菌E-test法微生物室如何选择真菌药敏试验1.常量稀释法：尽管对真菌药敏试验的标准化起推动作用但日常工作中难推广2.CLSI纸片法：单个药敏意义不大3.ATBFUNGUS3做真菌药敏试验较为可行。

且ATBFUNGUS3能提供MIC值。4.临床寄希望将来推行Etest法其是一个很有应用前景的临床实验室抗真菌药敏试验方法。YeastOne真菌药敏试验原理采用微量肉汤稀释法，药敏板上包被有不同稀释浓度的9种抗真菌药物，孔内含有显色剂。接种标准浓度的菌悬液后，在35℃培养箱内孵育24-72小时判读时孔内显示蓝色为生长抑制，有真菌生长则变为红色。既可肉眼判读，又能使用配套判读仪器判读最低抑菌浓度。阳性对照孔YeastOne真菌MIC药敏板条名称药敏检测对象特点YeastOne真菌MIC药敏板条（YO10）念珠菌属、隐球菌属、曲霉菌属9种抗真菌药每种药各有7-11个浓度24-72小时就能出结果专利的AlarmBlue显色技术，判读简单、清晰，很少有拖尾现象药物组成检测范围

包括念珠菌属、隐球菌属、曲霉菌属和其它可快速生长的酵母菌属

YeastOne真菌MIC药敏板条YeastOne真菌MIC药敏板条判读方便、清晰

红色：生长

蓝色：未生长机器判读Sensititre®VIZION预存板条药物布局点击孔位即可显示药物和浓度人工肉眼判读

病例分享（一）基本信息患者尹某，男，13岁，广东江门市人。主诉：发热半月余，腹痛10天，加重伴鼻衄1天。病史

2015-10-22，无明显诱因出现发热，达39.1℃并伴有寒战，无抽搐，无头痛头晕，伴有咳嗽，呈阵发性非痉挛性咳，有痰不易咳出，痰色黄，当地医院就诊。治疗：给予静滴“头孢类”（具体不详）及口服阿奇霉素、沐舒坦、退热药等治疗。

体温降至正常，仍有咳嗽，继续服药治疗。病史

2015-10-27，患儿再次出现发热，体温达39℃，伴有寒战，当地医院复诊，考虑“支气管扩张并肺部感染”。治疗：给予输液“头孢类”