微生物检验理论课 17螺旋体 学习资料

南方医科大学第三附属医院检验科陈佑明电话62784781邮箱cym38432@163.com螺旋体

(Spirochaeta)

教学内容与要求螺旋体的生物概念与生物特性螺旋体的分类及其所致疾病梅毒螺旋体感染患者的取材及实验室检测钩端螺旋体、疏螺旋体的生物概念及检测方法

螺旋体(Spirochaeta)是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状的运动活泼的单细胞原核生物。全长3～500微米，具有细菌细胞的所有内部结构。由核区和细胞质构成原生质圆柱体，柱体外缠绕着一根或多根轴丝。轴丝的一端附着在原生质圆柱体近末端的盘状物上，原生质圆柱体和轴丝都包以外包被，轴丝相互交叠并向非固着端伸展，超过原生质圆柱体，类似外部的鞭毛，但具外包被。

概论a:用电子显微镜观察负染制片螺旋体，轴丝、原生质柱及外鞘；

b:螺旋体的横截面。

用暗视野显微镜观察含活菌的新鲜标本，可看到运动活泼的螺旋体。结构特点一：

与细菌的相似之处是：具有与细菌相似的细胞壁，内含脂多糖和胞壁酸，以二分裂方式繁殖，无定型核（属原核型细胞），对抗生素敏感。结构特点二：

与原虫的相似之处有：体态柔软，胞壁与胞膜之间绕有弹性轴丝，借助它的屈曲和收缩能活泼运动，易被胆汁或胆盐溶解。在分类学上由于更接近于细菌而归属在广义的细菌范畴。螺旋体广泛分布在自然界和动物体内，根据螺旋数目、螺旋大小、螺旋距离及规则程度、生理特性及寄生宿主细胞不同,结合rRNA序列分析，螺旋体分为1目3科13属：第1科螺旋体科：9属疏螺旋体属（Borreliaspp），又名包柔氏螺旋体属密螺旋体属（Treponemaspp）第2科蛇形螺旋体科：2属第3科钩端螺旋体科：2属钩端螺旋体属（Leptospiraspp）

上述三属中可引起人患回归热和莱姆病、梅毒、钩端螺旋体病的致病菌。螺旋体地理分布疾病螺旋体科：第1科密螺旋体属梅毒螺旋体梅毒亚种T.pallidumsubspeciespallidum全世界梅毒（性传播）梅毒螺旋体雅司亚种 T.pallidumsubspeciespertenue热带亚洲、非洲、南美、中美雅司(皮肤损伤)梅毒螺旋体地方亚种T.pallidumsubspeciesendemicum非洲、东南亚、中东、南斯拉夫地方性非性病性梅毒（黏膜损伤）品他病密螺旋体T.carateum中美、南美品他病(皮肤损伤)梅毒样口腔螺旋体T.pallidum-likeoralspirochetes全世界坏死性齿龈炎疏螺旋体属

杜通疏螺旋体Borreliaduttonii全世界蜱传回归热

回归热疏螺旋体Borreliarecurrentis南美、欧亚、非洲、虱传回归热

伯氏疏螺旋体Borreliaburgdorferi北美、欧洲、澳洲莱姆病（硬蜱）奋森疏螺旋体

Borreliavincentii钩端螺旋体科：第3科全世界多种囗腔感染钩端螺旋体属问号钩端螺旋体（致病性钩端螺旋体）全世界钩端螺旋体病对人致病的螺旋体种类及致病情况

一、梅毒螺旋体

（TreponemaPallidum）微生物学

特

点◆透明：革兰染色阴性，不易着色，故又称苍白螺旋体。Fontana镀银染色螺旋体成被棕褐色。◆结构特点：细长，

7～8×0.1～0.15um，形似细密的弹簧，螺旋弯曲规则，平均8～14个，两端尖直。镀银染色油镜10x100倍微生物学

特

点电镜下观察：有细胞壁和细胞膜，壁膜之间有三条类似鞭毛样结构纤维组成的轴原纤维（也称轴丝endoflagella）,与运动有关。运动：移行“蛇”屈伸“爬虫”滚动环绕长轴的旋转◆微需氧或厌氧、横断分裂式繁殖◆体外培养困难◆在哺乳动物（家兔睾丸）体内繁殖Nichols株（毒力高）；细胞培养，最适宜的气体环境为3%-4%O2可培养成功Reiter株（毒力、活力低）。◆对温度、干燥均特别敏感，离体干燥1～2小时死亡，41℃中1小时死亡，50℃中5分钟死亡，在4℃置3天后可死亡，对化学消毒剂敏感，1～2%石炭酸中数分钟死亡，对青霉素、四环素、砷剂等敏感。

微生物学特性◆

梅毒螺旋体生活发育周期：（1）颗粒期（2）球形体期（3）螺旋体期◆平均约30小时增殖一代，发育周期与所致疾病周

期、隐伏发作及慢性病程有关。微生物学特性抗原分类抗原分为二类：1、密螺旋体抗原即梅毒表面特异性抗原：刺激机体产生特异的凝集抗体、制动抗体或溶解抗体。与其他密螺旋体存在共同抗原，有交叉反应。2、非密螺旋体抗原即磷脂类抗原：当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素（Aegagin），可与牛心肌或其他正常动物心肌提取的类脂质和胆固醇、卵磷脂混合物起沉淀反应或补体结合反应。发病机理淋巴结肿大螺旋体入侵局部皮肤或粘膜炎症反应小血管内皮细胞增生变厚、管腔填塞病灶区糜烂、溃疡渗出液致病物质：黏多糖、唾液酸、透明质酸酶、外膜蛋白◆人是梅毒的唯一传染源。◆先天性梅毒：患梅毒的孕妇经胎盘传染给胎儿。◆后天性梅毒：出生后感染的，其中95%是由性交直接感染，少数通过输血等间接途径感染。

临床意义：

先天性梅毒又称胎传梅毒。梅毒螺旋体经胎盘进入胎儿血循环，引起胎儿全身感染，螺旋体在胎儿内脏（肝、脾、肺及肾上腺）及组织中大量繁殖，造成流产、早产或死胎，如胎儿不死则称为梅毒儿，会出皮肤梅毒瘤、骨膜炎、马鞍鼻、锯齿形牙、神经性耳聋等症状。后天获得性梅毒表现复杂，依其传染过程可分为三期：

（1）一期梅毒：梅毒螺旋体侵入皮肤粘膜约三周后，在侵入局部出现无痛性硬结及溃疡，称硬性下疳。局部组织镜检可见淋巴细胞及巨噬细胞浸润。下疳多发生于外生殖器，其溃疡渗出物含有大量梅毒螺旋体，传染性极强。下疳常可自然愈合，约2～3个月无症状的隐伏期后进入第二期。

后天获得性梅毒表现复杂，依其传染过程可分为三期：

（2）二期梅毒：此期的主要表现为全身皮肤粘膜出现梅毒疹，全身淋巴结肿大，有时亦累及骨、关节、眼及其他器官。在梅毒疹及淋巴结中有大量螺旋体。不经治疗症状一般可在3周～3个月后自然消退而痊愈；部分病例经隐伏3～12个月后可再发作。二期梅毒因治疗不当，经过5年或更久的反复发作，而进入三期。

后天获得性梅毒表现复杂，依其传染过程可分为三期：

（3）三期梅毒：主要表现为皮肤粘膜的溃疡性损害或内脏器官的肉芽肿样病变（梅毒瘤），严重者在经过10～15年后引起心血管及中枢神经系统损害，导致动脉瘤、脊髓痨及全身麻痹等，此期的病灶中螺旋体很少，不易检出。

一、二期梅毒又统称为早期梅毒，此期传染性强而破坏性小。三期梅毒又称为晚期梅毒，该期传染性小，病程长、而破坏性大。

实验室检查一、病原体直接检查二、血清学实验（抗体检测）

（1）非梅毒螺旋体抗原血清学实验（2）梅毒螺旋体血清学实验三、核酸检测：TP-PCR

四、动物实验：兔感染试验病原体检查之一——暗视野显微镜法◆可直接观察到病灶分泌物中的梅毒螺旋体。◆结合临床症状可直接诊断梅毒。◆适用于早期梅毒的诊断。◆操作简单，经济、快速。◆对晚期及隐性梅毒患者或口腔病灶材料不适用。病原体检查之二——镀银染色（Warthin-Starry）法

◆梅毒螺旋体有嗜银特性，被染成黑褐色。◆阳性结果需谨慎解释，因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。病原体检查之三——免疫荧光染色◆待检组织样品通过单克隆抗体免疫荧光标记后，在荧光显微镜下可见荧光显色的梅毒螺旋体。病原体检查之四——多功能显微镜检测仪MDI◆一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，是在高清晰度的情况下连续放大40～15000倍。◆其特点是待检查标本不需染色及任何加工处理，而是将“活的”真实的样品直接进行观察，同时配有显示器、录像机和彩色激光打印机，可将观察结果同步录像和拍照。◆具有直接、方便、快速的优点。◆用于Ⅰ期梅毒诊断的阳性率为83.75%。◆但整套仪器价格昂贵,技术人员要有一定经验，很难普及到各个梅毒检测实验室。非梅毒螺旋体抗原血清学实验（初筛实验）1.瓦氏实验、康氏实验（敏感性低、特异性差）2.性病研究实验室实验VDRL

(venerealdiseaseresearchlaboratory)3.快速血浆反应素环状卡片实验RPR

(rapidplasmareagincirclecardtest)4.不加热血清反应素实验USR

(unheatedserumreagin)5.甲苯胺红不加热血清反应素试验TRUST

(Toluidinereaginunheatedserumtest)性病研究实验室实验VDRL◆

美国Pangborn等发明一种性病研究实验室抗原(VDRL)，是从牛心肌中提取的心磷脂，适量加入胆固醇及卵磷脂以提高敏感性，通常称这种抗原为心磷脂抗原。◆

属于微量玻片法，是唯一推荐用于检测脑脊液(CSF)反应素的试验。对诊断神经梅毒具有重要价值。◆

优点是操作简单，2h内出结果，试剂及对照血清已标准化，费用低。◆

缺点是Ⅰ期梅毒敏感性不高。快速血浆反应素环状卡片实验RPR◆

是20世纪80年代问世的非特异性梅毒血清学试验。◆

检测血清中非特异性抗体，所用抗原为标准的牛心肌脂抗原，主要用于Ⅰ期梅毒的诊断。◆

用于Ⅰ期梅毒阳性率为75%～85%。该方法有操作简便、迅速、结果容易判定、不需灭活、不需显微镜、抗原不需新鲜配制等优点，适用于大量标本检测。◆RPR试验和DF方法对Ⅰ期梅毒的诊断相互配合，可早期诊断梅毒。缺点是当抗体含量过高时，易出现假阴性反应，即前带现象(prozonephenomenon)，会有漏检及生物学假阳性反应。对潜伏期梅毒、神经梅毒不敏感。

不加热血清反应素实验USR◆

是VDRL抗原的改良，在玻片上做絮状反应,肉眼读取结果，本方法在我国目前广泛采用。◆

优点是血清不需加热灭活，抗原悬液可保存4个月，不需用时现配制，节省操作时间，但主观性强易出现漏检。USR与RPR试验可作为疗效观察或随访有否复发或再感染的指征。甲苯胺红不加热血清反应素试验TRUST◆

该试验所用的抗原是从牛心提取的心磷脂和从鸡蛋黄提取的卵磷脂及胆固醇。◆

与RPR方法比较，本试验是VDRL试剂中加了甲苯胺红溶液，阳性呈红色的不同程度的凝块悬于液体中，在白色纸卡上,结果清晰易读，简便快速，稳定性好，对非特异性反应素抗体导致的阳性标本TRUST法的检出率和重复性都强于RPR法，TRUST法比RPR、USR效价测定高一个滴度。◆

缺点是许多因素影响结果,如高脂血症和抗心磷脂抗体阳性的血清均可干扰而出现假阳性结果。而且该试验在非淋菌性尿道炎患者中存在生物学假阳性。自身免疫性疾病患者中也在生物学假阳性。梅毒螺旋体血清学实验1.荧光密螺旋体抗体吸收实验FTA-ABS

2.梅毒螺旋体荧光抗体双染色试验FTA-ABS-DS3.梅毒螺旋体抗体血球凝集实验TPHA4.梅毒螺旋体抗体明胶凝集实验TPPA

5.梅毒螺旋体抗体免疫印迹实验（Western

blotting）6.梅毒螺旋体抗体酶联免疫吸附实验TP-ELISA7.梅毒螺旋体抗体化学发光检测CMIA8.梅毒螺旋体抗体胶体金免疫层析法GICA

荧光密螺旋体抗体吸收实验FTA-ABS◆是以密螺旋体无毒株(Reiter株)抗原吸收待检血清，排除了同属抗原的交叉结合，保证了试验结果的特异性；以整条梅毒螺旋体检测血清中抗体，确保各种抗原分子的完整存在，提高了试验的敏感性。◆FTA-ABS-IgG不能反映病程活动性，不能诊断胎传梅毒，而用FTA-ABS-IgM检测IgM抗体来诊断胎传梅毒。它的主要缺点是需荧光显微镜设备，实验人员要有一定的专业技能和工作经验，尤其当标本荧光微弱病情可疑时，试验结果判定常带有主观色彩。梅毒螺旋体荧光抗体双染色试验FTA-ABS-DS◆技术要求较高，费时费钱，多用于实验室试验。梅毒螺旋体明胶凝集实验TPPA◆

目前国内较多医院常用于梅毒血清抗体检测方法之一。◆

将特异性梅毒螺旋体抗原包被在明胶颗粒上，与血清中的特异性抗体结合后出现肉眼可见的凝集反应的检测方法。◆

作为梅毒抗体检测的确证方法，有着很高的敏感度和特异性。◆

有文献报道TPPA的敏感性比TPHA好。操作较简便、结果易清晰判断，但价格昂贵和结果判断难以自动化等缺点限制其用于血站大规模的血液筛查。TPPA操作图TPPA结果判读梅毒血清试验结果判断

RPRUSRTRUSTTPHAFTA-ABS

TPPA反应结果判断阴性阴性阴性阴性

排除梅毒感染初期，尚未产生任何抗体；AIDS病人合并感染梅毒阴性阴性阳性阳性既往患梅毒；对FTA-ABS及TPPA非特异性反应阳性阴性阴性阴性生物性假阳性(BFP)；可疑早期梅毒阳性阴性阳性阳性早期梅毒；陈旧性梅毒阴性阳性阴性阴性梅毒治愈，对TPHA非特异性反应阴性阳性阳性阳性先天梅毒；梅毒治愈；其它螺旋体感染阳性阳性阴性阳性可疑既往患梅毒，梅毒螺旋体抗体消失阳性阳性阳性阳性梅毒(治愈或未治愈)

龙振华，邝捷，苗钢.《临床皮肤科杂志》2002年9月第9期

梅毒螺旋体免疫印迹实验◆是20世纪80年代发展起来的一种检测技术。◆结合了免疫学和分子生物学的特点，敏感性高，特异性强。该试验是通过电泳转移硝酸纤维膜抗原条上含有梅毒螺旋体的各种成分来确认是否梅毒感染。梅毒螺旋体酶联免疫吸附实验ELISA◆是一种基于基因工程的特异性检测技术，灵敏度和特异性均较高，特异性抗体在梅毒的潜伏期即产生约感染后2周，对梅毒的晚期辅助诊断较好。◆

可作为检验科的常规操作技术，操作简便，试剂价格比较便宜，适合血站献血者筛查、医院大批量体检和大、中型医院检验室对梅毒感染的晚期检查，但耗时比TRUST长，需要酶标仪、洗板机。其次要缺点该法检测的是梅毒IgM和IgG的混合抗体，梅毒IgG抗体治愈后相当长的时间内仍然具有较高的阳性率，以致终身阳性，因此，TP-ELISA阳性只说明正在感染或曾经感染过，不能判断梅毒疾病活动与否，所以不能作为疗效监测手段。核酸检测（TP-PCR）◆检测梅毒螺旋体DNA，特异性强敏感性高。◆检测样品：分泌物、组织、体液等。◆靶基因：tpf21、BMP、tmpA、tmpB、47kDa、16SrRNA、polA等◆临床意义：血清学阴性的早期梅毒、神经梅毒的诊断；区分胎传梅毒和母体梅毒。兔感染试验◆将标本接种于梅毒血清反应阴性的新西兰兔睾丸内，18～20℃、无抗生素饲料喂养，逐日观察睾丸。一旦炎症出现，抽取睾丸液作暗视野显微镜直接镜检，同时取血清做RPR或微量血清凝集反应，每三周一次，共三个月，两者阴性才能报告“无梅毒螺旋体梅毒亚种检出”。◆步骤繁琐，成本高，不适合临床检测。二、钩端螺旋体

（Leptospira)

病原学特点

◆引起钩端螺旋体病，也称钩体病。◆人畜共患。◆全世界各大洲均有流行。病原学特点◆菌体纤细、长丝状，长约6～12μm，直径0.1～0.2μm，约有18个螺旋。◆革兰染色阴性，着色较难。◆暗视野显微镜下可见细密、规则、

珍珠状排列的细链螺旋，两端弯曲成C、

S或8字形，运动活泼。◆基本结构：外膜、内鞭毛、原质柱状体，内鞭毛二根微生物学特性◆需氧生长。◆在pH7.2～7.4的含兔血清或TWEEN80的培养基上生长良好，约12～16小时繁殖一代。◆对热和酸的抵抗力弱，60℃1分钟即死亡；在0.2%来苏尔、1：2000升汞、1%石炭酸中10～30分即被灭活。◆对青霉素敏感，在酸碱度为中性的湿土或水中可存活20天，甚至数月。

抗原构造◆属特异性抗原:糖蛋白或脂蛋白，只存在钩端螺旋体属中。

genus-specificproteinantigen,GP-Ag◆群特异性抗原：存在钩端螺旋体内部，为脂多糖复合物。

serogroup-specificantigen◆型特异性抗原：在钩端螺旋体表部，为多糖蛋白复合物。

serovar-specificantigen血清分型◆世界：25个血清群270多种血清型◆中国：19个血清群160多种血清型◆常见：波摩拿群：分布最广

黄疸出血群：毒力最强流感伤寒群七日热群发病机理钩体入侵破损的皮肤或粘膜局部繁殖经淋巴系统或直接进入血循环毒素作用于全身各系统渗出液接触疫水全身重要器官毛细血管损害，功能障碍，DIC临床意义钩体病潜伏期为3～30天，分三期：（1）败血症期（2）器官损伤期（六型）流感伤寒型肺出血型黄疸出血型脑膜脑炎型休克型肾型（3）恢复期各种钩端螺旋体病的临床症状病型

型别

症状

体征流感伤寒型流感伤寒型、七日热型、波摩拿型发热、酸痛、全身不适、乏力眼结膜充血、腓肠肌疼痛、全身浅表淋巴结肿大、压痛肺出血型血痰、咯血五征象：面色苍白、青紫；心慌、烦燥；心率加快；呼吸急促；肺部啰音黄疸出血型黄疸出血型、秋季型、澳洲型、犬型黄疸、出血、肾损害脑膜脑炎型剧烈头痛、颈项强直、呕吐、畏光脑膜刺激症休克型脉细>100次/分、四肢厥冷、皮肤苍白、少尿收缩压<70mmHg肾型蛋白尿、少尿、重者无尿、酸中毒蛋白尿、管型尿、血尿、肾区叩痛实验室检验一、一般检验二、病原学检验三、血清学检验四、动物实验一般检验

钩端螺旋体入侵机体后产生的毒素会引起一系列的功能异常或紊乱（1）患者的白细胞总数增加；中性粒轻度增高或正常，黄疸出血型常增高（2）血沉持续增高（3）早期患者尿内可见少量蛋白、RBC、WBC及管型病原学检验（1）显微镜直接镜检（2）抗原检测（3）核酸检测（4）分离培养及鉴定病原学检验之一——显微镜直接镜检◆差速离心暗视野显微镜检查：适用于血、尿、脑脊液、尿液及组织标本的钩端螺旋体检查。

暗视野显微镜观察或Fontana镀银染色镜检病原学检验之二——抗原检测◆血、尿、脑脊液直接制成涂片或差速离心后的沉淀制成的涂片，空气干燥、丙酮固定后滴加荧光抗体，置湿盒37℃孵育后荧光显微镜检查，可见发出明显绿色荧光的细长呈C或S形、两端有钩的典型菌体，或短小、有3个螺旋、染色明亮的不典型菌体。◆缺点：一定比例的假阳性，荧光抗体的制备困难。病原学检验之三——核酸检测◆聚合酶链反应（PCR）：检测标本中钩端螺旋体特异DNA片段，如23SrDNA可诊断。通用引物G1-G2。◆DNA分子杂交：同位素、地高辛或生物素标记特异性DNA探针的杂交技术，检测患者或动物血液、尿中钩端螺旋体DNA。病原学检验之四——分离培养和鉴定◆Korthof培养基。◆28℃。◆pH7.2-7.6◆每周常规检查一次培养物，共5次，无钩端螺旋体生长才能报阴性结果。血清学检验（1）显微凝集试验（2）补体结合试验（3）间接凝集试验（4）溶血试验（5）酶联免疫吸附试验血清学检验之一——显微凝集试验

（macroscopicagglutinationtest,MAT)◆检测钩端螺旋体抗体的金标准◆所用抗原为活的钩端螺旋体◆待测血清用PBS缓冲液等倍稀释◆

单份效价1：400以上或双份血清效价增高4倍以上有诊断意义动物实验◆将可能感染有钩端螺旋体的疫水（或血液、尿液、脑脊液等）接种于幼年豚鼠的腹腔。◆每日监测，如生命体征出现明显变化（口、鼻、肛门出血、唇、眼、结膜、耳黄染及体温聚降至37℃以下），立即解剖，取肝肾组织作培养，肾切面压印片镀银染色或肾脏盐水漂洗液暗视野镜检。三、回归热疏螺旋体（B.recurretis）疏螺旋体的一种，是引起人类周期性反复发作回归热的病原体。可分二类：

虱传回归热（流行性回归热）蜱传回归热（地方性回归热）生物学特性：5-10个不规则的螺旋，运动活泼；革兰染色阴性，Giemsa染色呈紫红色。虱传回归热疏螺旋体与变形杆菌OX株有部分共同抗原。三、回归热疏螺旋体（B.recurretis）所致疾病：突然高热、头痛、肝脾肿大，发热持续1周左右骤退，同时血中螺旋体消失，间歇1-2周后又再次发热，血液中再次出现螺旋体，症状再现。反复发作3-10次，故称回归热。机制：螺旋体外膜蛋白易发生变异之故。微生物学检验：螺旋体检查：发热期采血，制成厚涂片，直接用暗视野显微镜检查或Giemsa染色或Wright染色后镜检。豚鼠对蜱型回归热疏螺旋敏感，对虱型有抵抗力。培养：蜱或患者血液接种于BSK培养基上。三、回归热疏螺旋体（B.recurretis）四、伯氏疏螺旋体（B.burgdorferi）是莱姆病的病原体。莱姆病最初于1977年在美国康涅狄格州的莱姆镇发现而得名，1982年由Burgdorferi从疫区的硬蜱及患者体内分离出伯氏疏螺旋体。自然疫源性疾病，流行较广。1985年我国在黑龙江省林区首次发现莱姆病，迄今已在十多个省区均有本病存在。生物学特性：形态：长10-40um,宽0.1-0.3um，两端稍尖，有3-10个大而稀疏不规则的螺旋。革兰染色阴性，但不易着色，Giemsa或Wright染色着色良好，呈紫红色，镀银染色呈棕褐色。运动方式：滚动、翻转、移动三种。四、伯氏疏螺旋体（B.burgdorferi）抗原成分：主要有鞭毛蛋白（41kD），外膜蛋白A(OspA)、B(OspB)、C(OspC)、60kD，脂蛋白等，分布于螺旋体的鞭毛、外膜及细胞膜上。培养特性：营养要求高，培养基需含有长链饱和与不饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和牛血清蛋白等。所致疾病与发病机制：莱姆病，人普遍易感。储存宿主：鼠类，传播媒介：硬蜱，潜伏期：3-30天，慢性移行性红斑（ECM），并伴有乏力、头痛、发热、肌痛等。未经治疗，约80%可发展至晚期：慢性关节炎、慢性神经系统或皮肤等异常。伯氏螺旋体致病机