《动物实验技术》课件-任务1：MCAO模型

动物实验技术MCAO模型建立原理思前想后脑梗死Cerebralinfarction脑梗塞Cerebralinfarction缺血性脑卒中（cerebralischemicstroke）又称脑梗死，旧称脑梗塞，是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。缺血性脑卒中——中国发病率与死亡率均据世界首位认识我国的“健康第一杀手”脑梗发病率死亡率持续居于榜首“健康第一杀手”“4高”特点·中国2010-2019年缺血性卒中的患病率由每10万1100增长至1256人·中国慢性病前瞻性研究对近50万名35-74岁既往无卒中或短暂性脑缺血发作的中国社区居民进行了9年随访，期间近46000名发生了首次卒中特点·其中10％的患者在发病28天内死亡，而存活的患者发病后5年内的卒中复发率为41％“4高”特点特点在2010至2019年期间均呈增长态势2019年出院患者人数约434万人相比2010年增长了约4倍患者人均住院费用增长37%缺血性脑卒中动物模型的常用造模方法人类脑卒中疾病类型动物模型缺血性脑卒中发病占比：75%-90%出血性脑卒中局灶性缺血模型全脑缺血模型人类脑缺血性疾病发作的常见类型大脑中动脉

栓塞模型（MCAO）国际普遍采用广泛认可型线栓法（最为经典）开颅电凝阻断法血栓形成法缺血性脑卒中动物模型的常用造模方法缺血性脑卒中出血性脑卒中脑卒中分为两类占比高达75%~90%缺血性脑卒中动物模型的常用造模方法全脑缺血模型局灶性脑缺血模型缺血性动物模型分为两类人类脑缺血性疾病发作的常见类型缺血性脑卒中动物模型的常用造模方法全脑缺血模型大脑中动脉栓塞模型（MCAO）缺血性动物模型分为两类国际普遍采用、广泛认可缺血性脑卒中动物模型的常用造模方法缺血性脑卒中出血性脑卒中脑卒中分为两类占比高达75%~90%缺血性动物模型分为两类全脑缺血模型局灶性脑缺血模型人类脑缺血性疾病发作的常见类型大脑中动脉栓塞模型大脑中动脉(Middlecerebralartery，MCA)是人群脑卒中的多发部位，MCA闭塞模型(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型。其发病机理与人类缺血性脑卒中表现相似，对于制作模拟人脑缺血模型对脑缺血发病机制及药物筛选有重要意义。方法阻断实验动物脑血管：线栓法开颅电凝阻断法血栓形成法线栓法的重要优势线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间等优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。本任务采用经典线栓法制备MCAO模型。总结通过上述动画，相信大家可以清晰掌握MCAO模型制备原理好的动物模型对复刻、还原人类疾病、促进医药健康领域的发展的重要意义。动物实验技术组织冰冻切片的制备冰冻切片的制备一、走进冰冻切片冷冻切片包埋剂（EmbeddingMatrixforFrozenSections），又称OCT冰冻切片包埋剂，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。冰冻切片的优势：1.操作简便、快速；2.组织不经有机溶剂的处理，不受浸蜡、包埋时高温影响，所以能较好地保存各种酶、抗原的活性及脂肪、类脂的结构。冰冻切片的缺点：组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位；冰冻切片比石蜡切片要厚，一般8-10μm，其清晰度相对石蜡切片较差；切片过程中易碎烂，不能用于回顾性研究；切片标本只能低温短期保存。一、走进冰冻切片肾组织中，小且少量冰晶肾组织中，大且多冰晶一、走进冰冻切片骤冷：将组织转移至液氮中数秒，在转移至超低温冰箱中保存。冷冻速度缓慢温度偏高细胞内冷冻不均匀所致减少冰晶的形成二、实验所需物品实验设备：冰冻切片机实验耗材：OTC固定剂；防脱载玻片三、冰冻切片制备流程与注意事项1.取材及包埋固定脱水后再行冰冻切片直接速冻切片再行后固定三、冰冻切片制备流程与注意事项1.取材及包埋冰冻切片的脱水方法与石蜡切片的脱水方法不同，使用的是蔗糖溶液。取新鲜组织常规固定后，采用20%和30%蔗糖溶液进行脱水。三、冰冻切片制备流程与注意事项1.取材及包埋通常两级浓度的蔗糖溶液进行过夜脱水处理，这种方式是通过高渗溶液吸收组织中的水分，从而实现脱水的目的；然后迅速转移至液氮中速冻，并于-80℃深冻冰箱中保存备用。三、冰冻切片制备流程与注意事项1.取材及包埋取新鲜组织，吸干周边水分，直接进行OCT包埋，并置于液氮中骤冷。切片后再经固定后使用，该种方式操作时间更短。三、冰冻切片制备流程与注意事项2.组织预冻（1）提前开启冰冻切片机降至工作温度（15~-20℃）。（2）取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分钟）。三、冰冻切片制备流程与注意事项2.组织预冻常用的包埋剂有OCT、B超耦合剂包埋剂的种类直接影响冰冻切片质量，包埋剂的用量也会影响标本冷冻质量。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。三、冰冻切片制备流程与注意事项2.组织预冻切片机冷冻箱及冷冻头温度高低要根据不同组织样本而定：温度过低会导致组织块过硬，切片碎裂，出现梯田状薄厚不均或空洞；温度过高,组织块硬度不够,切片不易成形或成皱褶，切片时应及时进行调整。三、冰冻切片制备流程与注意事项3.切片（1）将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平；（2）调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多、细胞稀的可稍为厚切，一般在10～20μm；三、冰冻切片制备流程与注意事项3.切片（3）调好防卷板、制作冰冻切片；切片关键点在于防卷板的调节，要求操作者要细心，准确调校至适当位置；切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。四、课程目标与任务对比石蜡切片技术内容，了解并掌握冰冻切片技术的重要性与广泛应用·知识目标对比石蜡切片技术内容，了解并掌握冰冻切片技术的重要性与广泛应用·能力目标培养勤思考、爱钻研的职业精神·素质目标动物实验技术MCAO模型评价-动物行为学评价思前想后任务一：实验动物抓取、保定技术任务二：实验动物编号、标记技术任务一：实验动物经口给药技术任务二：实验动物注射给药技术项目一：实验动物抓取、保定与编号、标记技术项目二：实验动物给药技术缺血性脑卒中MCAO模型模型建立原理手术流程与注意事项模型的评价与检测动物行为学观察与评价：Longa评分法病理组织学分析：TTC染色缺血性脑卒中MCAO模型模型建立原理手术流程与注意事项模型的评价与检测动物行为学观察与评价：Longa评分法病理组织学分析：TTC染色缺血性脑卒中MCAO模型模型建立原理手术流程与注意事项模型的评价与检测动物行为学观察与评价：Longa评分法病理组织学分析：TTC染色SD大鼠MCAO模型动物行为学检测与评价一、动物行为学检测与评价动物行为学检测作为动物整体生理和心理状态综合、全面和实时效应的反应，是研究人类疾病发病机制、新药效果评价、动物模型造模效果评估、基因功能等研究的一种重要技术手段；一、动物行为学检测与评价在生命科学、医学、药学、心理学等研究领域具有不可替代的地位。一、动物行为学检测与评价项目一：玩转“基因”的实验动物模块五：实验动物技术前沿资讯项目二：动物行为学检查项目三：肿瘤治疗中的“透视眼”-小动物活体成像技术项目四：动物实验技术行业发展趋势与动物实验技术员岗位介绍二、神经功能及行为学评价SD大鼠脑部局灶性缺血海马纹状体皮层导致感觉运动功能的障碍神经元损伤或死亡二、神经功能及行为学评价神经功能包括意识状态、运动、感觉、视觉、共济和神经反射等多方面，MCAO动物研究中，可根据动物的生理病理特点，从运动、感觉、意识、神经反射等方面检测动物的神经功能损伤和恢复程度。神经功能及行为学学评价不仅是判断模型成功与否的指标，也为观测病理生理发生发展的进程、模型规范化及药物干预的研究提供了一定的依据。Longa评分法MCAO模型评价二、神经功能及行为学评价三、Longa评分标准目标模型为1-3分最佳不能完全伸展对策前爪向对侧转圈向对侧倾倒四、Bederson评分法0分1分2分3分抓起动物的尾巴，使动物离台面10cm高。此时，正常大鼠的前爪处于伸直状态，而存在神经功能病变的动物则可出现如下表现：01.无神经功能缺陷：0分；02.动物尾巴提起后，瘫痪侧前肢回收并屈于腹下，而正常侧肢体伸向台面：1分；03.除第二条表现以外，俯卧于台面时向瘫痪侧侧推动物的阻力较正常侧明显降低：2分；04.除第一条和第二条以外，动物行走时向瘫痪侧旋转：3分。Bederson评分在1-3分，48小时内没有死亡，就认为模型成功。五、靶向定位、综合提升了解大鼠行为学评价应用范围与重要意义，为第五模块“动物行为学检测”项目的学习奠定基础·知识目标在了解神经功能学众多评价方法的基础上，重点掌握Longa评分与Bederson评分具体打分指标，并能熟练对本组及全班MCAO模型大鼠进行评分、评价·能力目标通过基本技能培训到复杂模型建立过程中，逐渐了解常用实验动物行为学特点，能敏锐辨别实验动物的常态、异态和病态，培养动物实验员“胆大心细”的优良品质·素质目标任务验收要点1.每组成员分别对本组MCAO模型大鼠与全班其他组MCAO模型大鼠、假手术组大鼠、正常组大鼠模型进行Longa评分；分别计算每只大鼠求组内平均值±标准差与班级平均值±标准差；记录实验数据、填写任务工单。2.以组为单位，查阅实验动物神经功能学评价方法（每组至少提交一种），包含但不局限与该神经功能学评价应用范围、必备仪器设备、评价方法与指标、数据分析与统计等内容，上传至学习通平台，进行分享交流；同时要求每位同学至少查阅一组有其他组同学上传的总结材料，并进行点评与学习分享。3.小组同学拍摄经全班投票、Longa评分在2-3分、MCAO模型建立较好的大鼠评分视频，上传至学习通平台供大家学习交流与分享，同时对该组同学本项目任务一成绩进行加分，以资鼓励。动物实验技术MCAO模型评价-组织学观察（TTC染色法）思前想后任务三：SD大鼠MCAO模型脑组织大体染色与分析（TTC法）项目四SD大鼠缺血性脑卒中模型（MCAO模型）的评价缺血性脑卒中MCAO模型模型建立原理手术流程与注意事项模型的评价与检测动物行为学观察与评价：Longa评分法病理组织学分析：TTC染色SD大鼠MCAO模型脑组织大体染色与分析（TTC法）不能完全伸展对策前爪向对侧转圈脑缺血究竟发生在大脑哪个部位？模型动物脑组织发生了哪些病理变化？SD大鼠MCAO模型脑组织大体染色与分析（TTC法）一、TTC染液与染色原理

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，是脂溶性光敏感复合物，常用于检测种子的生存能力以及检测哺乳动物组织的缺血梗塞。·染色原理TTC是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，能与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色。一、TTC染液与染色原理

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，是脂溶性光敏感复合物，常用于检测种子的生存能力以及检测哺乳动物组织的缺血梗塞。正常组织细胞中的脱氢酶可以将TTC还原成不溶性的红色稳定的三苯基甲臢(TTF)。·染色原理一、TTC染液与染色原理

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，是脂溶性光敏感复合物，常用于检测种子的生存能力以及检测哺乳动物组织的缺血梗塞。缺血组织中细胞内脱氢酶活性下降，则不能被染色或染色较浅；因此可以根据染色部位和染色深浅程度来分析、统计脑组织梗死面积。·染色原理树立目标了解TTC染色剂性质与染色原理，掌握TTC染色流程与注意事项。知识目标能独立、标准完成大鼠处死、组织取材、脑片制备等工作任务；在掌握TTC染液特点与染色注意事项的基础上，能熟练运用TT