探索生物科技的前沿领域

,、生物技术的I定义

生物技术(biotechnology),有时也称生物工程(bioengineering),是指人

们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术

手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或到

达某种目的。因此，生物技术是一门新兴的、综合性的学科。

先进的工程技术手段是指基因工程、细胞工程、酹工程、发酵工程和蛋白质工程

等新技术。改造生物体是指获得优良品质日勺动物、植物或微生物品系。生物原料

则指生物体H勺某一部分或生物生长过程所能运用H勺物质，如淀粉、糖蜜、纤维素

等有机物，也包括某些无机化学品，甚至某些矿石。为人类生产出所需日勺产拈包

括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等多种产品。到达某种目日勺则包括

疾病的防止、诊断与治疗、环境污染H勺检测和治理等。

二、生物技术的研究内容

根据生物技术操作的I市象及操作技术日勺不一样，生物技术重要包括如下5项技

术(工程)。

(1)基因工程

基因工程(geneengineering)是应用人工措施把生物的遗传物质(DNA)分离

出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞

或个体，从而变化它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息(基因)在新的宿主

细胞或个体中大量体现，以获得基因产物(多肽或蛋白质)。这种发明新生物并

予以新生物以特殊功能的过程就称为基因工程，也称为DNA重组技术。

(2)细胞工程

细胞工程(cellengineering)是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、

繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生变化，从而到达改良生

物品种和发明新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种

有用的物质日勺过程。细胞工程应包括动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技

术(也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。

(3)发酵工程

发醉工程(fermentationengineering)是运用微生物生长速度快、生长条件简

朴以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下通过现代化工程技术手段，由微生物

『与某种特定功能生产出人类所需日勺产品称为发酵工程，有时也称微生物工程。

(4)酶工程

酶工程(enzymeengineering)是运用酶、细胞器或细胞所具有日勺特异催化功能，

或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的I一项

技术。它包括酶H勺固定化技术、细胞H勺固定化技

术、酶日勺修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。

（5）蛋白质工程

蛋白质工程（proteinengineering）是指在基因工程口勺基础上，结合蛋白质结

晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定

向改造等手段，从而到达对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要

区）新型蛋白质。

一、改善农业生产、处理食品短缺

（1）提高农作物产量及其品质

1、培育抗逆的作物优曳品系

通过基因工程技术对生物进行基因转移，使生物体获得新的优良品性，称之为转

基因技术。运用转基因技术可以培育出具有抗寒、抗旱、抗盐、抗病虫害等抗逆

特性及品质优良的作物新品系，如转苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis,

Bt）毒蛋白基因的抗虫棉花。

2、植物种苗的工厂化生产

运用细胞工程技术对优良品种进行大量的迅速无性繁殖，实现工业化生产，即植

物微繁殖技术，又称植物微繁殖技术。运用这种无性繁殖技术，可在短时间内得

到遗传稳定的、大量的小苗（试管苗），并可实现工厂化生产。运用植物微繁殖

技术还可培育出不带病毒的脱毒苗。

植物的微繁殖技术已广泛地应用于花卉、果树、蔬菜、药用植物和农作物的迅速

繁殖。

3、提高粮食品质

生物技术除了可培育高产、抗逆、抗病虫害口勺新品系外，还可培育品质好、营养

价值高日勺作物新品系。例如I,科学家将水仙花和玉米合成B-胡萝卜素H勺基因导

入水稻培育出高胡萝卜素含量的水稻（GoldenRice,黄金稻）（图1-1）o

图1T黄金稻

a：一般水稻；b：转水仙花B-胡萝卜素合成基因水稻；c：转玉米胡萝卜素

合成基因水稻

4、生物固氮，减少化肥使用量

现代农业均以化学肥料，如尿素、硫酸核作为氮肥的重要来源。化肥的使用不可

防止地带来了土地的板结，肥力的下降；化肥的生产又将导致环境的污染。科学

家们正努力将具有固氮能力口勺细菌的固氮基因转移到作物根际周围的微生物体

内，但愿由这些微生物进行生物固氮，减少化肥口勺使用量。

5、生物农药，生产绿色食品

近年来，人们越来越注意农业生产的可持续发展及人与环境H勺协调，尤其是由于

化学农药的毒性作用及筛选新农药的艰难，企业和研究人员开始把注意力转向生

物农药日勺研究开发与使用。因其不污染环境，对人和动植物安全，不伤害天敌,

因此发展生物农药已成为保障人类健康和农业可持续发展的重要趋势。

（2）发展畜牧业生产

1、动物的大量迅速无性繁殖

1997年2月英国Roslin研究所H勺Wilmut等在《Nature》杂志上刊登了用绵羊

乳腺细胞培育出“多莉”（图1-2）。证明动物体细胞也具有全能性，同样有也

许进行动物日勺大量、迅速无性繁殖。

图1-2“多莉”及其代孕母亲（苏格兰黑面绵羊）

二、培育动物的优良品系

运用转基因技术，将与动物优良品质有关的基因转移到动物体内，使动物获得新

的品质。1983年美国学者将大鼠的生长激素基因导入小鼠获得转基因小鼠。除

了小鼠外，科学家们已成功地培育了转基因羊、转基因兔、转基因猪、转基因鱼

等多种动物新品系。

2、提高生命质量，延长人类寿命

（1）开发制造奇特而又宝贵的新型药物

1977年，美国首先采月大肠杆菌生产了人类第一种基因工程药物一人生长激素

释放克制激素。运用基因工程生产日勺药物，除了人生长激素释放克制激素外，尚

有人胰岛素、人生长激素、人干扰素等。

（2）疾病的防止和诊断

老式的疫苗生产措施走某些疫苗H勺生产和使用，存在着免疫效果不够理想、被免

疫者有被感染的风险等局限性。运用基因工程生产重组疫苗可以到达安全、高效

的目的。如已经上市或已进入临床试验的病毒性肝炎疫苗；肠道传染病疫苗（包

括霍乱、痢疾等）等。

运用细胞工程技术可以生产单克隆抗体。单克隆抗体既可用于疾病治疗，乂可用

于疾病日勺诊断。运用基因工程技术还可生产诊断用的DNA试剂。

（3）基因治疗

导入正常的基因来治疗由于基因缺陷而引起日勺疾病，一直是人们长期以来追求的

RWo1990年，美国FDA同意了用ADA（腺首脱氨酶基因）基因治疗严重联合型免

疫缺陷病，并获得了较满意的成果。

三、处理能源危机、治理环境污染

（1）处理能源危机

生物能源将是最有但愿日勺新能源之一，而其中又以乙醇最有但愿成为新日勺替代能

源。科学家们但愿找到一种可以运用大量的农业废弃物如杂草、木

屑、植物的秸杆等纤维素或木质素类物质或其他工业废弃物作的微生物。通过微

生物发酵或固定化酶技术，将农业或工业的废弃物变成沼气或氢气。

(2)环境保护

老式的化学工业生产过程大多在高温高压下进行，是一种经典的耗能过程并带来

环境的严重恶化。假如改用生物技术措施来生产，不仅可以节省能源还可以防止

环境污染。例如用化学措施生产农药，不仅耗能并且严重污染环境，如改用苏云

金杆菌生产毒性蛋白，即可节省能源并且该蛋白质时人体无毒。

四、制造工业原料、生产宝贵金属

(1)制造工业原料

运用微生物在生长过程中积累的代谢产物，生产食品工业原料，种类繁多。概括

起来，重要有如下几种大类：①氨基酸类，重要有谷氨酸(即味精)、赖氨酸、异

亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、缴氨酸等；②酸味剂，重要有柠檬酸、乳酸、苹果

酸、维生素C等；③甜味剂，重要有高果糖浆、天冬甜精、氯化砂糖。

发酵技术还可用来生产化学工业原料。重要有老式的通用型化工原料如乙醇、丙

酮、丁醇等产品。

(2)生产宝贵金属一、基因工程的定义

在漫长日勺生物进化过程中，基因重组历来没有停止过。在自然力量及人类干扰下,

通过基因重组、基因突变和基因转移等途径，生物界无止境地进化，，不停使物

种趋向完善，出现了今天各具特性口勺繁多物种。有H勺能忍耐高温,有日勺不怕寒冷,

有的能适应干旱日勺沙漠，有日勺可在高盐度时海滩上或海水中生繁，有的能固定大

气中的氮素……种种生物的特殊性状成为今天定向改造生物、发明新物种的丰富遗

传资源。不过没有一种生物是完美无缺的，因此，有待科技工作者有目的地去深

入改造。按照人们的愿望，进行严密的设计，通可体外DNA重组和转移等技术,

有目的地改造生物特性，在较短的时间内使既有物种的性能得到改善，发明出更

符合人们需要的新的生物类型，或者运用这种技术对人类疾病进行基因治疗，这

就是基因工程。

基因工程最突出的长处是打破常规育种难以突破口勺物种之间的界线，可以使原核

生物与真核生物之间，动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行

互相重组和转移。

在冶金工业方面，面对数量庞大的废渣矿、贫矿、尾矿、废矿，采用一般的采矿

技术已无能为力，惟有运用细菌的浸矿技术才能对此类矿石进行提炼。可浸提的

金属包括金、银、铜、铀、锦、铝、锌、钻、锲、领、钝等10多种宝贵金属和

稀有金属。

1、基因工程研究H勺理论根据

（1）不一样基因具有相似日勺物质基础

地球上几乎所有日勺生物，从细菌到高等动物和植物直至人类，它们日勺基因都是一

种具有遗传信息的JDNA片段。所有生物日勺DNA»、J构成和基本构造都是同样的J。因

此，不一样生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然有些病毒的

基因是RNA,但这些病毒的RNA仍可以通过反转录产生cDNA（comp1omentaryDNA,

互补DNA）,并不影响不一一样基因之间日勺重组。

（2）基因是可以切割口勺

基因直线排列在DNA上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间

隔序列。因此，作为及抓分子上一种特定核甘酸序列H勺基因，容许从DNA分子上

一种一种完整地切割下来。

（3）基因是可以转移日勺

基因不仅是可以切割下来的，并且携带基因日勺DNA分子可以在不一样生物之'可转

移，或者在生物体内的染色体上迁移，甚至可以在不一样染色体间跳跃，插入到

靶DNA分子中。由此表明，基因是可以转移日勺，并且是可以重组日勺。转移后日勺基

因一般仍有功能。

（4）多肽与基因之间存在对应关系

普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组最终可以

根据其体现产物多肽的性质来考察。

（5）遗传密码是通用的

所有生物从低等的病毒直至人类，蛋白质合成都使用同一套遗传密码，只有少数

例外，也就是说遗传密码是通用欧J。重组的DNA分子不管导入什么样的生物细胞

中，只要具有转录翻译口勺条件，其上面的遗传密码均能转录翻译出对应的氨基酸。

虽然人工合成的JDNA分子（基因），其上面的遗传密码同样可以转录翻译出对•应

的氨基酸。

（6）基因可以通过复制把遗传信息传给下一代

经重组日勺基因在合适条件下是能传代的，可以获得相对稳定日勺转基因生物。

3、基因工程操作H勺基本技术路线

基因工程是一项比较复杂的技术，假如抛开细节问题，基因工程操作的基本技术

路线如图2T所示。

图21基因工程的基本技术路线

以上技术路线概括为4个环节：①获得目的基因；②构建克隆载体；③目的基因

与克隆载体重组后导入受体细胞；③获得克隆子；④对克隆子中目的基因进行检

测和鉴定。

一、DNA的构成与构造

（1）DNA的构成

DNA是一类由4种脱氧核甘酸按照一定日勺次序聚合而成的大分子。脱氧核甘酸分

子由脱氧核糖、磷酸和碱基构成。脱氧核糖日勺第一位碳原子（1’）上连接一种碱

基，第5位碳原子（5'）上连接一种磷酸基团，构成一种脱氧核昔酸。一种脱氧

核甘酸H勺脱氧核糖的5'磷酸基团和另一种脱氧核甘酸的脱氧核糖的3'羟基结合

形成磷酸二酯键，把两个脱氧核甘酸连接在一起。多种脱氧核甘酸按此方式连接

成多聚脱氧核甘酸，其一端为游离的5'磷酸基团（5'-P）,称为5'端，而另一

端为游离的3'羟基（3'-0H）,称为3'端（图2-1）。假如连接成的多聚脱氧核

甘酸是环状的，则无游离的J'端和3,端。

图27DNA口勺一段多聚脱氧核甘酸链

构成DNA的碱基有腺喋吟（A）、鸟噂吟（G）、胞喀咤（C）、胸腺喀咤（7）4

种，分别具有这4种碱基的脱氧核苜酸依次称为腺噂吟脱氧核甘酸、鸟噂吟脱氧

核甘酸、胞喀呢脱氧核甘酸和胸腺喀呢脱氧核甘酸。多聚脱氧核苜酸链中，多种

脱氧核甘酸H勺脱氧和糖和磷酸的构造和位置是一致的，

不一样日勺只是碱基，因此多聚脱氧核甘酸链（DNA链）中欧J脱氧核甘酸可以用碱

基来表达。例如5'端开始依次由脱氧鸟甘酸、脱氧胞甘酸、脱氧胞昔酸、脱氧

腺甘酸、脱氧胸昔酸连接成的多聚脱氧核昔酸片段可用碱基5'-GCCAT-3'表达。

（2）DNA时构造

DNA一般以双链形式存在。两条脱氧核甘酸链总是按碱基A与T、G与C互补配

对，通过氢键形成稳定日勺双螺旋构造，称为双链DNA（图2-2）。绝大部分生物细

胞中『、JDNA都是双链，只有少数病毒（噬菌体）中欧JDNA以单链形式存在。

图2-2DNA双链示意图

二、DNA的功能

（1）DNA分子能在细胞内复制

DNA的功能之一是在细胞内可以进行半保留复制。复制后，新产生日勺双链DNA分

子中具有一条旧链和一条新链，使DNA携带日勺信息可以精确传递。

（2）携带遗传信息

DNA是生物界遗传信息口勺重要携带者，DNA上的部分核甘酸序列决定着RNA口勺核

甘酸序列。通过转录，这些核甘酸序列分别指令转录出核糖体RNA（rRNA）、转

移RNA（IRNA）和信使RNA（mRNA）。rRNA是核糖体的一部分；IRNA在蛋白质合

成过程中转运氨基酸；mRNA上的核在酸序列编码蛋白质的氨基酸序列，通过翻

译把遗传信息深入传递给蛋白质（多肽）。

基因应包括转录启动子H勺序列和转录区的序列。在转录过程中，构成启动子曰勺序

列不转录出对应H勺RNA序列，只有转录区的序列才转录出对应的RNA序列。

•种基因或一种操纵子能否有效转录，首先取决于其上游与否存在有效的启动子。

启动子是RNA聚合酶识别和结合日勺位点。转录区从转录日勺起始位点开始，包括基

因编码区和转录终止子。

基因编码区指转录mRNA上起始密码AUG(少数为GUG)至终止密码UAG(UAA、

UGA)口勺多种遗传密码口勺核甘酸序列。原核生物的转录区有口勺是由2个或2个以

上基因构成的操纵子。构成同一操纵子的所有基因共用一种启动子，不过每个基

因的编码区都具有起始密码序列和终止子序列，两个基因编码区之间往往具有非

编码的间隔序列。真核生物的转录区，一种启动子只控制转录一种基因的编码区,

但编码区内除了多种编码序列以外，往往具有一种或几种长度不一样的非编码间

隔序列区，称为内含子(intron)。被内含子分隔的编码序列，称为外显子(exon)。

在基因编码区下游有一段使转录终止H勺核甘酸序列，称为转录终止子

(terminator)。一种操纵子虽然由多种基因构成，但与启动子同样也只需要一

种终止子。

一、限制性核内切酸酶和DNA片段化

(1)限制性核内切酸酶

限制性内切核酸酶(restrictioncndo-endonuclease)能识别双链DNA中特定核

在酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生

具5'-磷酸基(-P)基和3'-羟基(-0H)/、JDNA片段的内切脱氧核甘酸酶

(endo-deoxyribonuclease)。至今发现日勺限制性内切核酸酶有I型酶、II型酶和

in型酶。基因工程操作中真正有用日勺是n型酶。假如没有专门阐明，一般所说的

限制性内切酶就是n型酶。

(2)限制性核内切酸酶的识别序列

限制性内切核酸酶在双链DNA分子上能识别口勺特定核甘酸序列

称之识别序列。多种限制性内切核酸酶均有对应的识别序列。如，限制性内切核

酸酶EcoRi日勺识别序列为GAATTCo

有某些限制性内切核酸酶虽来源不一样，但有相似的识别序列，这样的限制性内

切核酸酶称为之同裂酶，如BamHI和BstI具有相似的识别序列GGATCCo

(3)限制性内切核酸酶的酶切位点

DNA在限制性内切核酸酶的作用"使多聚核甘酸链上磷酸二脂键断开的位置被

称为酶切位点，用I表达。限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点一般是在识别

序列内部,如GIGATCC。

DNA分子经限制性内切核酸酶酶切产生日勺末端因所用的酶不一样而不一样。两条

多聚核甘酸链上磷酸二酯键端开日勺位置假如是交错的，产生H勺DNA片段末端的一

条链多出1至几种核甘酸，这样的末端称为粘性末端。DNA片段末端5,端比3'

端长的称为5'粘性末端,3'端比5,端长H勺称为3'粘性末端。假如两条多聚

核甘酸链上磷酸二酯键断裂后产生的DNA片段末端是平齐的,称为平末端。不管

是粘性末端还是平末端,5'端一定是-P基团，3，端一定是0H基团。

有些限制性内切核酸酹虽然识别序列不一样，但酶切DNA分子产生日勺DNA片段具

有相似日勺粘性末端，这样的J一组限制性内切核酸酶称为同尾酶。

二、特异性DNA片段的PCR扩增

1983年体外扩增DNA片段的措施产生，即聚合酶链反应

（polymerasechainreaction,PCR）。采用这种措施，在反应系统中只要有一种待

扩增的DNA拷贝，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的待扩增DNA片段，可满足

用于常规措施的DNA检测和DNA重组。

（1）PCR基本原理

PCR是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行欧J,以DNA互补链聚合反应为基础，

通过靶DNA变性、引物与模板DNA（待扩增DNA）一侧日勺互补序列复性、耐热性DNA

聚合酶催化引物延伸等过程日勺多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反

应过程是:①反应系统加热至90-95C,双链DNA变性成为两条单链DNA（变性），

作为互补链聚合反应的模板；②降温至37-60℃,使两种引物分别与模板DNA链

链的13'一侧的互补序列杂交（复性或退火）；③升温至70-75℃,耐热性DNA聚

合酶催化引物按5'f3'方向延伸合成模板DNA链日勺互补链（延伸）。反复以上

过程，通过25-30次循环，就可以出现随待扩增H勺特异性DNA片段（图2-3）。

图2-3PCR扩增特异性PCR片段过程

（2）耐热性DNA聚合酶

耐热性DNA聚合酶的发现，使PCR扩增特异性DNA片段成为也许。由于这种酶在

靶DNA变性日勺高温下仍保持活性，因此在PCR扩漕特异性DNA片段日勺全过程中，

只需一次加入反应系统中，不必在每次高温变性处理后再添加酶。目前用于PCR

的耐热性DNA聚合酶重要有：TaqDNA聚合、Pw。酶等。

（3）PCR引物

PCR引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补链合成

的一种脱氧核甘酸寡聚体，其3'端必须具有游离的-0H。引物按预先设计月化

学措施合成，其长短与PCR过程H勺特异性高下亲密有关。一般来说，引物越长，

特异性越高。为扩增特异性高的DNA片段，一般设计的引物由20-30核苜酸构成。

三、DNA片段的化学合成

（1）合成引物

除上述日勺PCR引物外，常用日勺尚有核甘酸序列测序引物及合城cDNA的引物等。

（2）合成DNA寡聚核甘酸连杆

寡聚核甘酸连杆（linker）是一种按预先设计，化学合成日勺寡核苜酸片段。寡聚核

苜酸连杆一般由8T2个核苜酸构成，以中线为轴两侧互补对称。其上有一种或

几种限制性内切核酸酶H勺识别序列，使连接了寡聚核甘酸连杆的DNA片段通过这

些限制性内切核酸酣酶切后，可以产生一定日勺粘性末端，便于与具有相似粘性末

端的另一DNA片段连接。假如连杆日勺两端已具有一种或两种限制性内切核酸酶酶

切产生日勺粘性末端，可直接使两DNA片段连接，也称为衔接头或接头（adaptor）。

（3）合成基因片段

根据某基因测定口勺核甘酸序列，或者根据蛋白质氨基酸序列推导口勺核甘酸序列，

可以用DNA自动合成议化学合成对应的基因片段。

一、DNA连接酶

DNA连接酶（DNAligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3'-011与5'-P之

间形成磷酸二酯键（图2-4）。DNA连接酶重要有大肠杆菌（E.coli）DNA连接

酶和T4噬菌体DNA连接酶。E.coliDNA连接酶只能催化双链DNA片段互补粘性

末端之间的链接；T4DNA连接酶既可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的链

接，也可催化双链DNA片段平末端之间日勺链接,但平末端之间链接日勺效率比较低。

图2-4DNA连接反应示意图

二、DNA片段之间的链接

（1）互补粘性末端片段之间的链接

链接反应一般可用E.coliDNA连接酶，也可以用T4DNA连接酶（图2-5）。待连

接的两个DNA片段假如是同一限制性内切核酸酶酶切H勺，连接后仍保留原限制性

内切核酸酶日勺识别序列。假如用两种同尾酶酶切的，虽然产生相似日勺互补粘性末

端，可以进行有效日勺连接，但获得日勺重组DNA分子往往缺乏了本来用于酶切的那

两种限制性内切核酸酝日勺识别序列。

图2-5互补粘性末端片段之间的链接

（2）平末端DNA片段之间的链接

链接反应需用T4DNA连接酶。只要两个DNA片段是平齐H勺，不管是用限制性内切

核酸酶酶切产生日勺，还是其他措施产生日勺，都可以进行连接（图2-6）。假如在

两种不一样限制性内切核酸酶酶切后产生的平齐末端DNA片段之间进行连接，连

接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶H勺识别序列。假如两个DNA片段

日勺末端是用同一限制性内切核酸酶酶切产生日勺，

连接后日勺DNA分子仍保留那种酶日勺识别序列，有的还出现另一种新日勺限制性内切

酶欧T识别序列。

图2-5平齐末端片段之间的链接

三、DNA片段修饰后的链接

待连接日勺两个DNA片段通过不一样限制性内切核酸酶酶切后，产生日勺末端不是互

补的粘性末端，或者一种是粘性末端另一种是平末端。在这种状况下，链接之前

必须对两个末端或一种末端进行修饰。修饰H勺方式重要是采用外切核酸酶将粘性

末端修饰成平末端；采用末端脱氧核甘酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修

饰成互补粘性末端；采用DNA聚合酶将粘性末端修饰成平末端。有时为了防止待

连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA,或自行连接成二聚体，可采用碱性磷

酸酶使其中一•种DNA片段5,端-P修饰成-0H,即去磷酸化。

4、DNA片段加连杆或接头后连接

假如要连接既不具互补粘性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了用修饰一种

或两种DNA片段末端后进行连接H勺措施外，还可以采用人工合成连杆或接头。先

将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段末端，然后用合适的限制性内切酶酶

切连杆，使待连接日勺两种DNA片段具互补粘性末端，最终在DNA连接酶崔化下使

两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。若在DNA片段末端加的是接头，不需运

用限制性内切酶酶切。

一、克隆载体

在转基因研究中，单独一种包括启动子、编码区和终止子日勺基因，或者构成基因

日勺某个元件，一般不轻易进入受体细胞，虽然采月理化措施进入细胞后，也不轻

易在受体内稳定维持。把可以承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持

日勺DNA分子称为基因克隆载体(genecloningvector)。

作为基因克隆载体一般应当具有如下条件：①在克隆载体合适的位置必须具有外

源DNA片段组入的多克隆位点(multiplecloningsite),对于某种克隆位点来

说，在载体上一般只有一种。②一般能在携带外源DNA(基因)进入受体细胞后，

或停留在细胞质中进行自我复制;或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA,

随这些DNA的复制而同步复制；或自成染色体同其他染色体同样自行复制。③必

须具有供选择转化子的标识基因或汇报基因。④必须是安全日勺，不具有对受体细

胞有害日勺基因，并且不会任意转入除选定时受体细胞以外的其他生物细胞，尤其

是人肝J细胞。

基因克隆载体示意图

二、基因工程常用质粒载体

质粒（plasmid）是一种存在于宿主细胞中染色体外的裸露DNA分子，一种质粒

就是一种DNA分子。质粒具有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自主复制，但

不会像某些病毒那样进行无限制H勺复制，导致宿主细胞H勺瓦解。每个质粒在对应

日勺宿主细胞内保持相而稳定日勺拷贝数，少数几种，多者

上百。质粒DNA分子小时局限性2kb,大时可达lOOkb以上，多数10个kb左右。

（1）大肠杆菌质粒载体

大肠杆菌质粒载体是一类应用广泛的克隆载体，具有大肠杆菌源质粒的复制起始

位点，可以在转化的大肠杆菌中进行复制。

1）pBR322质粒载体

PBR322是一种经典的营用质粒载体。pBR322由大肠杆菌源质粒ColEl衍生H勺质

粒pMBl为基础构建而成,具有ColElH勺复制起始位点（Col-ori），能在大肠杆

菌细胞中进行高拷贝复制。具有选择标识基因Ampr和TetroAmpr基因区的PstI

和PvuI的识别位点,Tetr基因区的ClaI>HindllkBamllI和SalI等的识别

位点是常用日勺克隆位点。PBR322分子大小为4363bp,可以克隆10kb如下的I外源

DNA片段。

质粒载体PBR322

2)pUC18/19质粒载体

PUC18/19质粒载体具有pBR322H勺复制起始位点，具有选择标识基因Ampr和

lacZ',并在lacZ'区组装了多克隆位点(MCS)连杆，外源DNA片段插入MCS的任

一克隆位点后，导致lacZ'基因失活，可提供菌落蓝/白选择标

记，并且插入MCS日勺外源基因可以在lac启动子调控下进行体现。pUC18与pUC19

日勺差异只是MCS连杆上日勺克隆位点以相反的方向排列。

PUC18/19质粒载体

(2)农杆菌Ti质粒载体

根癌农杆菌具有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时会引起植物产生肿瘤(冠

瘦瘤)，因次称此质粒为此质粒(tumorinducingplasmid)0

根癌农杆菌引起植物产生肿瘤

Ti质粒是一种双链环状DNA分子，其大小为200kb,不过能进入植物细胞区I只是

一小部分，约25kb,称为T-DNA(transferDNA)0T-DNA左

右两边界（LB,RB）各有一种选择标识基因25bpBU正向反复序列（LTS和RTS）,对

T-DNA的转移和整合是不可缺乏的J,并且己证明T-DNA只要保留两端边界序列，

虽然中间的序列不一样程度被任何一种外源DNA片段所替代，进入植物细胞后仍

可整合到植物基因组中。根据Ti质粒H勺这个性质，近年来构建成含LB和RB的J

质粒载体，已被广泛地用于植物H勺基因转移。

Ti质粒克隆载体示意图

（3）T克隆载体

诸多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一

种突出日勺碱基A。T克隆载体是一种已经线性化日勺载体，载体每条链的3'端带

有一种突出日勺T°T克隆载体的两端就可以和PCR产物日勺两端进行对时日勺AT配对,

在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到T克隆载体中，形成具有目的片断

日勺重组载体。

PBM19-T克隆载体示意图

病毒重要由DNA（或RNA）和外壳蛋白构成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，

病毒颗粒进入宿主细胞，运用宿主细胞的DNA（或RNA）复制系统和蛋白质合成系

统进行DNA（或RNA）的复制和外壳蛋白口勺合，实现病毒颗粒口勺增殖。

一、噬菌体载体

（1）人噬菌体载体

入噬菌体由DNA(入DNA)和外壳蛋白构成(图a),对大肠杆菌具有很高的感染

能力。入DNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端

各有12个核甘酸构成口勺5'突出粘性末端(cohcsivccnd)(图b),并且两者核昔

酸序列互补，进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，将此末端称为

cos位点(cohcsivccndsite)。入噬菌体能包装入DNA原长75%-105%的IDNA片段,

36.4-51kb,并且入DNA上约有20kb时区域对入噬菌体的生长不是绝对需要的，

可以缺失或被外源DNA片段取代。

入噬菌体示意图

构建入噬菌体克隆载体H勺方略是：①用合适的限制性内切核酸酶切去入DNA上的

部分或所有非必需区，对应保留这种前日勺1个或2个识别序列和切割位点作为克

隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等措施使必需区内的这

种能的识别序列失效，防止外源DNA片段插入必需区。②若有必要可在非必需区

组入选择标识基因。③构建日勺入DNA载体不应不不小于36.4kb。由此构建成X

噬菌体载体。

构建入噬菌体载体的示意图

(2)cosmid载体

由于X噬菌体载体自身必须不小于36.4kb,限制了容许克隆的外源DNA片段。

研究发现只要保留入DNA两端各不少于280bp的片段，并且该片段内具有cos

位点及与包装有关的核苜酸序列；当插入外DNA片段后总长不小于36.4kb,不

不小于51kb；这样的亘组入DNA分子就能进行有效包装和转导受体细胞。根据

这一性质构建了cosmid载体。cosmd载体是一种环状双链DNA分子，由质粒DNA

和部分入DNA构成。

cosmid载体示意图

质粒部分具有大肠杆菌源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标识基因等基本构

件，可以像质粒载体同样承载外源DNA片段，转化大肠杆菌受体细胞，并在其中

自行复制和增殖。入DNA部分容许重组人DNA分子进行有效包装和转导受体细胞。

不过由于cosmid载体不具X噬菌体溶菌生长途径，因此不产生子代噬菌体。

cosmid载体一般在lOkb如下,能承载比较大(40kb左右)日勺外源DNA片段，被

广泛地用于构建基因组文库。

二、植物病毒克隆载体

植物病毒种类繁多，已用于构建植物载体的有双链DNA病毒花椰菜花斑病毒

(CaMV),单链DNA病毒番茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木木薯花叶病毒洲CMV)、

玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV),以及大麦条纹花叶病毒(BSMV)、番茄

丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草花叶病毒(TMV)等。

构建植物病毒克隆载体的基本方略是对病毒DNA(包括RNA反转录口勺DNA)进行加

工，消除其对植物口勺致病性，保留其通过转导或转染能迸入植物细胞口勺特性，使

其携带口勺目口勺基因能导入植物细胞。由于植物病毒克隆载体的应用局限性比较大,

因此植物病毒载体应用并不普遍。

运用CaMV感染植物后能启动35SRNA转录的强启动子，构建含35S启动子的)高效

体现载体(图2T6),能启动目日勺基因在植物细胞中进行高效欧J体现。

35s启动子示意图

三、动物病毒克隆载体

由于动物转基因不能应用质粒克隆载体，因此动物病毒克隆载体在动物转基因研

究中起着更重要日勺作用。目前，用于构建克隆载体的动物病毒有痘苗病毒

(poxvirus),腺病毒(adenovirus)、杆状病毒(bacuovrus)、猿猴空泡病毒

(simianvacuolatingvirus)和反转录病毒(retrovirus)等。

一、人工染色体载体

质粒载体、病毒(噬菌体)克隆载体各具长处，但它们能承载的外源DNA片段大

小一般不超过50kbo显然这些载体限制了对具有庞大和复杂功能的人和高等动

植物基因组日勺研究。因此，伴随构造基因组学和功能基因组学研究的发展，以及

实行人类基因组计划和动植物基因组计划的需要，能承载大片段DNA的人工染色

体载体应运而生，并且发展迅速。人工染色体是指能在宿主细胞中稳定地复制并

精确传递给子细胞的人工构建的染色体。由于人工染色体能承载lOOkb以上的

DNA大片段，因此又称为大DNA片段克隆载体。目前已构建的人工染色体从其构

造来分可分为两类，即线形口勺人工染色体和环形的人工染色体。

线形的人工染色体如同真核生物口勺染色体同样，必须具有染色体的构造元件端粒

(telomere)>着丝粒(centromere)和复制起始区制nofreplication)。端

粒对染色体DNA两个末端起封口和保护作用。着丝粒负责染色体向子细胞的传递。

复制起始区日勺功能是负责启动染色体的复制，使构建的人工染色体能在宿主细胞

中稳定地复制并精确传递给子细胞。属于这一类#J人工染色体有酵母菌人工染色

体(yeastartificialchromosome,YAC)植物人工染色体(plantartificial

chromosome,PAC)、人类人工染色体(humanartificialchromosome,HAC)和

哺乳动物人工染色体(nammalartificialchromosome,MAC)等。

环形的人工染色体则不需要端粒和着丝粒，但必须具有合适口勺复制起始区，使构

建的环形人工染色体能在宿主细胞内稳定地复制，并在细胞分裂过程中分派到子

细胞中。属于这一类的人工染色体有细菌人工染色体(bacterialartificial

chromosome,BAC)>源于噬菌体Pl的人工染色体(Plderivedartificial

chromosome,PAC)、双元细菌人工染色体(binaryBAC,BT-BAC)>可转化人工

染色体(transformationcompetentartificialchromosome,TAC)。

不管是哪一类人工染色体，作为DNA片段克隆载体，还必须具有合适的克隆位点

和选择标识基因等克隆载体必备H勺元件。

2、基因体现载体

作为基因体现载体，在构建H勺载体中除了一般克隆载体必备日勺构件外，在插入目

的基因日勺克隆位点上、下游，还应有供目的基因转录mRNA必备的启动子和终止

子，与目日勺基因在受体细胞内日勺体现强弱亲密有关。其中启动子尤为重要，在构

建体现载体时常用的启动子有诱导启动子和组织恃异性启动子，构建的载体对应

称为诱导型体现载体和组织特异性体现载体。

(1)诱导型体现载体

诱导型体现载体指载体中的启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或较

高转录活性口勺体现载体。外源基因处在这样n勺启动子下，必须在合适的诱导条件

下才能体现。采用这种体现载体获得的转基因生物便于人工控制，虽然进入自然

环境中，由于不存在合适口勺诱导条件，不能体现外源基因产物，因此不易导致环

境污染和影响生态系统的平衡。可以认为这是一类较安全酌基因体现载体。并且

鉴于诱导体现载体能人为地控制基因时空的体现，将为基因治疗的临床应用及基

础研究提供良好的手段。目前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子、

红光诱导启动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子，等等。

(2)组织特异性体现载体

在较高等的真核生物中，有一类特殊的启动子只有在一定的组织中才能调控其下

游的基因进行有效的体现。选用这样的启动子可以构建一系列组织特异性体现载

体，为研究动植物发育和人类基因治疗等提供有效日勺手段。目前，己构建的组织

特异性体现载体有乳腺组织特异性体现载体、肿瘤细胞特异性体现载体、花药特

异性体现载体和种子特异性体现载体。

在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、变化受体细胞性状和获得预期体现

产物的基因称为目的।基因。目欧।基因一般是构造基因，也就是能转录和翻译出多

肽(蛋白质)的।基因。

一、目H勺基因的J来源

目的基因重要来源于多种生物。真核生物染色体基因组，是获得目日勺基因的重要

来源。原核生物的染色体基因组也是目的基因来源日勺候选者。线粒体基因组、叶

绿体基因组，以及质粒基因组和病毒（噬菌体）基因组也可从中获得有特殊需要

的目的基因。此外，化学合成的DNA也是目日勺基因的来源之一。

二、分离目口勺基因的途径

根据试验需要，待分高口勺目H勺基因也许是一种基因编码区，或者包括启动子和终

止子的功能基因；也许是一种完整的操纵子或由几种功能基因、几种操纵子汇集

在一起日勺基因簇；也也许只是一种基因H勺编码序列，甚至是启动子或终止子等元

件。常采用的措施重要有酶切直接分离法、PCR扩增法、构建基因组文库或cDNA

文库分离法、化学合成法等。

（1）运用限制性内切核酸酶酶切法直接分离月H勺基因

为了获得己克隆在载体中的目的基因，只要根据目日勺基因两侧的I限制性内切核酸

酶识别序列，用合适的限制性内切核酸酶酶切，一次就可获得目日勺基因，如图

2T7所示，用BamHI和EcoRI酶切此质粒，就可获得目的基因。

图2T7用限制性内切核酸酶法获得目H勺基因示意图

（2）运用PCR直接扩增目的基因

PCR扩增技术己广泛地用于分离目的基因。假如懂得目日勺基因的全序列或其两侧

序列，可以通过合成一对与模板DNA互补欧J引物，十分有效地扩增出含目的基因

的DNA片段（图2-18）。

图2T8PCR扩增目的基因示意图

（3）通过构建基因组文库和cDNA文库分离目的基因

1）基因组文库

把某种生物基因组的所有遗传信息通过克隆载体储存在一种受体菌克隆子群体

中，这个群体即为这种生物的基因组文库（图2-19）。若这个群体中只储存某种

生物基因组日勺部分遗传信息，则称为部分基因组文库。

用于构建基因组文库的克隆载体有X噬菌体克隆载体、cosniid克隆载体、BAC

克隆载体、BIBAC克隆载体、PAC克隆载体和YAC克隆载体等。

图2T9基因组文库构建意图

2）cDNA文库

某种生物基囚组转录的所有mRNA经反转录产生的多种cDNA片段分别与克隆载体

重组,储存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库（图2-20）o

假如此群体中只储存该基因组的部分cDNA,则称为部分cDNA文库。cDNA文库的

一种克隆子包括一种基因的所有编码序列，不含内含子，也不含转录启动子和终

止子的核甘酸序列。因此从cDNA文库中获得的目的基因在其两侧必须组装上转

录启动子和终止子等元件。用于构建cDNA文库的载体有质粒载体和噬菌体克隆

载体。

图2-20cDNA文库构建意义图

3）从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因

构建了某生物的基因组文库或cDNA文库，不过并不等于完毕了目H勺基因H勺分离，

由于文库中究竟哪一种克隆子具有需要的目日勺基因尚不得而知。因此必须用合适

日勺措施从文库中筛选分离出具有目的基因的特定克隆子。

根据目日勺基因已知核昔酸序列进行筛选分离

这是分离目日勺基因最直接的措施，根据目的基因已知的核甘酸序列制备核酸探针,

对基因组文库或cDNA文库H勺•系列克隆子日勺DNA分子进行杂交，能杂交的克隆

子就具有目的基因（阳性克隆子）（图221）o深入对阳性克隆子重组DNA进行

测序，与已知基因的核甘酸序列进行比较和鉴定，

确定与否是待分离的目口勺基因。应用这种措施可以比较以便地获得目的基因，不

过获得口勺基因一般不是新的基因。

图2-21运用核酸杂交鉴定目的基因

根据目H勺基因特异性体现进行分离

有的基因只有在某生物日勺一定的生长发育阶段或一定日勺器官中才能体现，这样的

基因可用此措施获得。洌如，待分离的目日勺基因只有在植物的根中才能有效体现,

而在其他器官中（如植物的叶）不能体现，因此用根构建的cDNA文库中具有携

带目的基因cDNA的克隆子。根据这一性质以根和

叶的总mRNA（或它们的cDNA）为探针,分别对根构建的cDNA文库进行杂交比较。

用根的总mRNA（或它们的cDNA）制备的探针对cDNA文库进行杂交时，所有克隆

子都呈阳性反应；而用叶的总mRNA（或它们的cDNA）制备口勺探针进行杂交时，

根cDNA文库中的某些克隆子呈阴性反应。最终比较2份杂交成果，便可以在根

cDNA文库转膜的大量菌落中挑选出含目的基因的菌落（图2-22）。将这种分离

目的基因的措施称为差异杂交筛选法，这种措施也可用于分离受生长因子调整的

基因及特殊处理诱导体现的基因。

图2-22差异杂交筛选示意图

细胞。无论是原核生物细胞还是真核生物细胞都可作为受体细胞，但不是所有的

细胞都可以作为受体细胞。选用受体细胞时应考虑如下几点：①便于外源DNA

分子的导入，并在其内能稳定维持。②便于克隆子（转化子）日勺筛选。③遗传性

稳定，对遗传密码H勺应用上没有明显对遗传密码的应用上无明显偏倚性，适于外

源基因日勺高效体现、体现产物的分泌或积累；对于真核生物目日勺基因的高效体现,

还应具有很好的翻译后加工机制。④易于扩大培养或发酵生长，具有较高的生产

应用价值和理论研究价值。⑤安全性高，不会对外界环境导致生物污染。

一、原核生物细胞

原核生物细胞是较为理想的受体细胞(图2-5T),其原因是：①大部分原核生

物细胞没有纤维素构成日勺坚硬细胞壁，便于外源DNA的导入。②没有核膜，染色

体DNA没有固定结合的蛋白质，便于外源DNA与裸露的染色体DNA重组。③基因

组小，遗传背景简朴，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因

进行遗传分析。④原核生物多数为单细胞生物，轻易获得一致性日勺试验材料，并

且培养简朴，繁殖迅速，试验周期短，反复试验快。因此原核生物细胞普遍作为

受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者作为克隆载体的宿主菌，或者

用来建立生产某种目的基因产物H勺工程菌。不过，以原核生物细胞来体现真核生

物基因也存在一定的缺陷，诸多未经修饰的真核生物基因往往不能在原核生物细

胞内体现出具有生物活性的功能蛋白。不过通过对真核生物基因进行合适的修饰,

或者采用cDNA克隆等措施，原核生物细胞仍可用作体现真核生物基因的受体细

胞。至今被用作受体细胞的原核生物重要是大肠砰菌(Escherichiacoli).此

外,乳酸菌(lacticacidbacterium)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)>棒状杆

菌(corynebacterium)和蓝细菌(cyanobacterium；等也被用作受体细胞。

图2-5-1原核生物细胞模式图

二、真核生物细胞

真核生物细胞具有真核生物基因体现调控和体现产物加工日勺机制，因此作为受体

细胞体现真核生物基因优于原核生物细胞。真菌、植物和动物的I细胞都被用作基

因工程日勺受体细胞。

酵母菌属于单细胞真菌，是外源真核生物基因理想的体现系统。酵母菌作为基因

工程受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有如下长处：①基因构造

相对比较简朴，对其基因体现调控机制研究得比较清晰，便于基因工程操作。②

培养简朴，适于大规模发酵生产，成本低廉。③外源基因体现产物能分泌到培养

基中，便于产物H勺提取和加工。④不产生毒素，是安全的受体细胞。

植物细胞作为基因工程受体细胞（图2-5-2）,除了真核生物细胞共有的特性外，

最突出口勺长处就是其全能性，即一种分离的活细胞在合适的培养条件下，比较轻

易再分化成植株，这意味着一种获得外源基因口勺体细胞可以培养出能稳定遗传的I

植株。局限性之处是植物细胞有纤维素参与构成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组

DNA分子。不过采用农杆菌介导法或用基因枪、电

激仪处理等措施，同样可使外源DNA进入植物细胞。目前用作基因工程受体H勺植

物有水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草和拟南芥等。

图2-5-2植物细胞模式图

动物细胞作为受体细胞（图2-5-3）,同样便于体现具有生物活性日勺外源真核生

物基因产物。不过初期由于对动物附体细胞全能性的研究不够深入，因此多采用

生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因工程的I受体细胞，获得了某些转基因动

物。近年来，由于对干细胞日勺深入研究和多种克隆动物的获得，表明动物时体细

胞同样可以用作转基因日勺受体细胞。目前用作基因工程受体的动物有猪、羊、牛、

鱼、鼠、猴等。

图2-5-3动物细胞模式图

目前用于重组DNA分子导入受体细胞的措施诸多，详细采用那一种措施，应根据

选用的载体系统和受体细胞类型而定。

一、外源DNA转化措施

通过生物学、物理学和化学等措施使外源裸露DNA分子引入受体细胞，并在受体

细胞内稳定维持和体现日勺过程称为转化（transformation）。假如引入受体细胞的I

是经包装处理带有外源DNA分子日勺病毒或噬菌体颗粒，此过程称为转染

（transfection）。下面简介几种比较常用的）转化措施。

（1）化合物诱导转化法

用二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）处理某些受体细胞.可以使其成为感受

态细胞，即处在能摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。当外源DNA分子溶液同

感受态细胞混合时，DNA分子便可进入细胞，到达转化的目日勺。

有的动物细胞能捕捉粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。

根据这一特性，先将待转化的外源DNA同CaC12混合制成CaC12-DNA溶液，在强

烈振荡下缓慢加入缓冲液，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物，然后用吸管将沉淀

复合物加入到哺乳动物单层培养细胞的表面上，保温几小时后，可使外源DNA

进入细胞。

外源DNA与某些多聚物和二价阳离子混合，再与受体细胞或原生质体混合，也可

使外源DNA进入细胞。常用FJ多聚物有聚乙二醇:PEG）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨

酸等，尤以PEG应用最广，可用于原核生物细胞、动物细胞和植物原生质体H勺基

因转化。

（2）根癌农杆菌介导口勺Ti质粒载体转化法

具有Ti质粒H勺根癌农阡菌与某些植物日勺细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）

导入植物细胞，整合到植物基因组DNA,随基因组DNA的复制而复制（图2-5-4）o

根据这一特性构建了一系列Ti质粒载体，与含目的基因的DNA片段重组，寻人

根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共墙

养法和悬浮细胞共培养法，通过根癌农杆菌介导进入植物细胞。用根癌农杆菌介

导法己获得了某些转基因植物，不过通过此措施转化获得转基因单子叶植物比较

困难。

图2-5-4根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化

（3）微弹轰击转化法

微弹轰击转化法又称基因枪转化法，这是通过高速运行口勺金属颗粒轰击细胞，将

包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒导入细胞的转化措施（图2-5-5）o

基因枪法简朴迅速，可直接处理植物组织，接触面积大，并有较高的转化率。

图2-5-5基因枪法转移外源基因

（4）脂质体介导法

脂质体（liposome）是由磷脂双分子层构成口勺人工膜状构造，将DNA分子包在其

内，通过脂质体与与原生质体的吞噬过程，将外源DNA导入受体细胞内（图

2-5-6）o此措施口勺长处是在脂质体内口勺DNA可以防止细胞内核酸酶的降解，因

此可直接转化外源DNAo

图2-5-6脂质体介转化

（5）花粉管通道转化法

此措施只用于植物。植物授粉过程中，将外源DNA涂在柱头上，使DNA沿花粉管

通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁日勺卵、合子及初期日勺

胚胎细胞。由于这一措施技术简朴，易于掌握，能防止体细胞变异等长处，具有

一定时应用前景。

图2-5-7花粉管通道法导入外源基因

（6）精子介导法

此措施只用于动物，是指精子同外源DNA共浴后再给卵子受精，使外源DNA通过

受精过程进入受精卵并整合于受体的基因组中。近年来还采用了电穿孔、脂质体

包埋等辅助手段，提高了精子介导法H勺可靠性和可行性。

二、病毒（噬菌体）颗粒转导法

用病毒（噬菌体）的DNA（或RT-DNA）构建的I克隆载体（或携带目日勺基因），在

体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受

体细胞，将此过程称为病毒（噬菌体）颗粒转导（transduction）法。该措施重要

用于动物的转基因，初期也用于植物的转基因。

病毒（噬菌体）颗粒转导法重要是用经包装处理带有目的基因的病毒（噬菌体）

颗粒直接感染受体细胞，使目的基因随同病毒（噬菌体）DNA分子整合到受体细

胞染色体DNA上，这样后来不必再包装成病毒（噬菌体）颗粒。假如带有目口勺基

因欧I病毒（噬菌体）是缺陷型的，则需同另一辅助病毒（噬菌体）一起感染受体

细胞，在受体细胞内包装成新口勺病毒（噬菌体）颗粒。不过，假如受体细胞的基

因组中早已整合有病毒（噬菌体）缺陷的DNA片段，则没有必要用辅助病毒做混

合感染。

一般将摄取外源DNA分子并在其中稳定维持H勺受体细胞称为克隆子。重组DNA

分子在转化或转染过程中，一般仅有少数受体细胞成为转化子。因此，必须采用

合适的措施从大量的受体细胞背景中筛选出期待H勺转化子。

一、根据载体标识基因筛选转化子

在构建基因工程载体时，一般在载体DNA分