新教材高中生物选择性必修3课件：第3章 实验突破二　DNA片段的扩增及电泳鉴定(人教版)

实验突破二

DNA片段的扩增及电

泳鉴定一、实验原理1.DNA片段的扩增PCR利用了

原理，通过调节

来控制DNA双链的______

。2.琼脂糖凝胶电泳(1)带电粒子：DNA分子具有

的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上

或

。(2)迁移动力与方向：在

的作用下，带电分子会向着与它所带电荷

的电极移动，这个过程就是电泳。DNA的热变性温度解聚与结合可解离正电荷负电荷电场相反(3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的

、DNA分子的

和

有关。(4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的

灯下被检测出来。浓度大小构象紫外二、方法步骤1.移液：用

按照配方或PCR试剂盒的说明书，在___________中依次加入各组分。2.混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。3.离心：将微量离心管放在离心机上，离心约

s，使反应液集中在管的

。4.反应：将装有反应液的微量离心管放入

中，设置程序进行反应。5.根据待分离的DNA片段的

，用

配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为

的琼脂糖溶液，并加入适量的

染料混匀。微量移液器微量离心管10底部PCR仪大小电泳缓冲液0.8%～1.2%核酸6.将扩增得到的PCR产物与

(内含指示剂)混合，再用___

将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。7.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为

。待指示剂前沿迁移接近

时，停止电泳。8.电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。凝胶载样缓冲液微量移液器1～5V/cm凝胶边缘三、操作提示1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行

处理。2.缓冲液和酶应分装成小份，并在

储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上

融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。高压灭菌－20℃缓慢四、关键点拨1.未出现扩增条带的主要原因(1)TaqDNA聚合酶失活。(2)引物出现质量问题。(3)Mg2＋浓度过低。(4)变性时的温度

，变性时间短。2.出现非特异性扩增条带的主要原因(1)模板DNA出现

。(2)引物特异性不强或形成引物二聚体。(3)Mg2＋浓度

。(4)复性时的温度

等。低污染过高过低例1下列关于电泳的说法，错误的是A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C.DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度有关D.用琼脂糖凝胶电泳，DNA的电泳迁移速率完全取决于分子的大小√解析DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。例2用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是A.PCR产物的分子大小在250～500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号确定反应体系等对结果没有干扰√解析PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500bp，A正确；3号PCR结果包含250～500bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。1.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前

必须进行高压灭菌处理B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20℃储存C.将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上

的枪头都必须更换跟踪训练123456√2.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述，错误的是A.PCR过程需要TaqDNA聚合酶B.PCR过程通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合C.PCR扩增区域由两种引物来决定D.电泳时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度有关，与DNA分子的大小无关12345√6解析PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以复制过程中要用耐高温的DNA聚合酶，A正确；PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物，由于DNA的两条模板链反向平行，所以复制时需要两种引物，且PCR扩增区域由这两种引物来决定，C正确；电泳时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，D错误。1234563.(2021·北京海淀区模拟)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是123456A.该载体最可能为环状DNA分子B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶R1与R2的酶切位点最短相距约200bpD.限制酶切割时会导致作用位点的氢键和肽键断裂√解析当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度约为800bp的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；123456两种限制酶同时切割时则产生长度约为600bp和200bp的两种DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点的磷酸二酯键，D错误。4.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定步骤的说法，错误的是A.PCR过程中，需要加入两种引物B.所有组分加入微量离心管后，需要放入离心机离心约10sC.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜D.电泳出现位置不等的几条条带，说明鉴定的PCR产物比较纯净123456√解析电泳出现位置不等的几条条带，说明存在长短不一的DNA片段，鉴定的PCR产物不纯净，D错误。5.用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如图所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是123456A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C.第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个是等长

的，也就是有2个X基因D.第四轮复制得到16个DNA分子，

其中有4个X基因123456√解析第二轮复制得到4个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，故得到①②③④各一个，B正确；123456第三轮复制得到8个DNA分子，①复制得到①和③，③复制得到③和⑤，②复制得到②和④，④复制得到④和⑤，故得到①和②各一个，③和④各两个，⑤两个且等长，即2个X基因，C正确；123456第四轮复制得到16个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，两个③复制得到两个③和两个⑤，两个④复制得到两个④和两个⑤，两个⑤复制得到四个⑤，故第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。123456.(2021·江苏南通模拟)PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种组分的优化组合，下列相关叙述错误的是A.反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否B.设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量C.TaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物的增多D.目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置6√12345解析PCR体外扩增需要DNA做模板，所以反应体系中模板DNA的量和纯度会影响PCR的成功与否，A正确；设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量，以保证