新教材高中生物选择性必修3课件：3 2 1 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建人教版

第2节基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建目的基因的筛选与获取自主梳理1.筛选合适的目的基因预期表达产物蛋白质毒物降解已知结构功能清晰2.利用PCR获取和扩增目的基因DNA半保留复制PCR扩增仪(PCR仪)耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸受热变性50引物72耐高温的DNA聚合酶3′指数琼脂糖凝胶电泳(1)目的基因主要是编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。()(2)筛选目的基因的主要方法是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。()(3)PCR需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。()提示：PCR不需要解旋酶的参与。(4)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。()√√×√[典型例题]

(2020·北京高二期末)实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是(

) A.90℃以上时DNA的磷酸二酯键断开 B.引物与模板结合后向5′方向延伸 C.反应过程包括变性→复性→延伸 D.需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶

解析

90℃以上时是DNA的氢键断开，A错误；引物与模板结合后向3′方向延伸，B错误；反应过程包括变性→复性→延伸，C正确；PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D错误。

答案CPCR技术与细胞内DNA复制的比较[变式训练]

(2019·福建高二期末)下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(

)A.①过程所需的原料是核糖核苷酸 B.②过程所需的酶必须耐高温C.③过程需要解旋酶破坏氢键 D.④过程的引物对之间不能互补配对解析

①过程为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；②过程由DNA单链合成DNA双链过程所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；③过程为变性，温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，不需要DNA解旋酶破坏氢键，C错误；④过程为复性，温度降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。答案

D科学探究——PCR

下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：素养提升(1)经过第几轮扩增后，扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？提示：第3轮；1/4。(2)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？提示：不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。[典型例题]

(2019·玉溪市江川区第二中学高二开学考试)PCR技术中，如何设计引物(

) A.PCR引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计 B.PCR引物要根据已知的DNA序列对应的RNA序列来设计 C.PCR引物要根据已知的DNA序列对应的tRNA的序列来设计 D.以上都不是正确方法

解析设计引物就是直接根据基因序列来设计，即根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，A正确。

答案

A[变式训练]

(2019·安徽师范大学附属中学高二期中)关于PCR技术的说法不正确的是(

) A.PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B.PCR过程中只需要两个引物分子 C.PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶 D.PCR过程中DNA合成方向是5′到3′解析

PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中DNA合成方向是5′到3′，D正确。答案

B联想质疑★PCR的一个循环过程在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。另外，也可以采用人工合成目的基因的方法。

1.细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？

提示：需要；因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。2.PCR过程中，如果两种引物之间互补序列较长的话，会有什么样的结果？

提示：可能造成复性过程中，引物之间相互结合，从而使引物不能很好地与模板DNA链结合。3.用PCR可以扩增mRNA吗？

提示：不能。PCR的原理是DNA复制，只可用于扩增DNA。PCR需要的引物数量1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出2n个DNA片段，共需要引物数量为2n—2个。基因表达载体的构建自主梳理稳定存在表达上RNA聚合酶下产生相同末端DNA连接酶同种提醒：(1)启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。(2)构建基因表达载体时，可以用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段；也可以用能产生相同末端的不同限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。(3)由于限制酶识别的核苷酸序列通常是回文序列，所以经一种和几种限制酶切割后形成的黏性末端如果是相同的，也一定是互补的。(4)有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。(1)一个完整的基因表达载体由目的基因、标记基因、起始密码子、终止密码子和复制原点等组成。()提示：一个完整的基因表达载体由目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点等组成。(2)启动子位于目的基因的上游，是转录的起始位点，是一段有特殊序列结构的DNA片段。()提示：启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点，启动子紧挨目的基因的转录起始位点。××(3)构建基因表达载体时，必须使用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。()提示：构建基因表达载体时，可以用同一种限制酶或能产生相同末端的不同种限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段。×[典型例题]

(2020·黑龙江双鸭山一中高二期末)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(

)A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC.图示过程是基因工程的核心步骤D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构解析卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A正确；构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，C正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。答案

B[变式训练]

(2019·天津静海一中高三月考)图甲、图乙分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是(

)A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma

Ⅰ切割B.图甲所示的质粒分子在经Sma

Ⅰ酶切割后含有4个游离的磷酸基团C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以解析据图分析，质粒中，Sma

Ⅰ的切割位点位于标记基因(抗生素抗性基因)上，在外源DNA分子中，Sma

Ⅰ的切割位点位于目的基因上，因此用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用Sma

Ⅰ切割，A正确；图甲所示的质粒分子只有一个Sma

Ⅰ切割位点，所以在经Sma

Ⅰ酶切割后含有2个游离的磷酸基团，B错误；为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶，C错误；只使用EcoRⅠ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用DNA连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamHⅠ或HindⅢ剪切时，在目的基因上只有一个酶切位点，因此不能切割目的基因，D错误。答案

A素养提升科学思维——批判性认识“单酶切法”和“双酶分别切割法”构建基因表达载体时，可以采用以下两种方法(如下图)：①单酶切法：用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段；②双酶分别切割法：用两种能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段。(1)已知BamHⅠ和BgIⅡ识别的核苷酸序列和切割位点分别为：则DNA分子经BamHⅠ和BgIⅡ切割后所形成的末端是否互补(相同)?提示：互补(相同)。(2)黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接？3与4呢？为什么？此现象说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”具有什么缺点？提示：均能，因为这两种限制酶切割后形成的黏性末端互补(相同)。说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”会导致载体和目的基因的自身环化。(3)黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接？此现象说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”具有什么缺点？提示：均能。说明“单酶切法”和“双酶分别切割法”会导致载体与目的基因的反向连接。[典型例题]

(2020·成都七中高二月考)在构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶去切割载体和目的基因所在的DNA分子。下列相关叙述错误的是(

) A.可以选择同一种限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子 B.可以选择能产生相同末端的两种限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子 C.可以选择一种限制酶去切割载体，另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)去切割目的基因所在的DNA分子 D.构建基因表达载体时，除了要用到限制性内切核酸酶之外，还要用到DNA连接酶解析选择一种限制酶去切割载体，另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)去切割目的基因所在的DNA分子，将会导致目的基因两侧的黏性末端与载体切口处的两个黏性末端不能互补，因而无法连接形成重组载体。答案

C[变式训练]

(2020·漯河四高高二期末)构建基因表达载体时，应选择用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因所在的DNA分子。下列相关叙述中，正确的是(

) A.用同一种限制酶时，会导致载体和目的基因的自身环化，以及目的基因与载体的任意链接 B.用能产生相同末端的限制酶时，能避免载体和目的基因的自身环化，以及目的基因与载体的任意链接 C.能产生相同末端的限制酶其识别的核苷酸序列和切割位点一定是相同的 D.能产生相同末端的限制酶其识别的核苷酸序列和切割位点一定是不同的解析用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶时，都会导致载体和目的基因的自身环化，以及目的基因与载体的任意连接，A正确、B错误；能产生相同末端的限制酶，其识别的核苷酸序列和切割位点不一定相同，如BamHⅠ的识别序列和切割位点为－G↓GATCC－，BgIⅡ的识别序列和切割位点为－A↓GATCT－，两者的识别序列和切割位点不同，但形成的黏性末端是相同的；又如XbalⅠ和XhoⅠ两种限制酶的识别序列和切割位点均为－C↓TCGAG－，C、D错误。答案

A联想质疑目的基因导入植物细胞时常选用植物的体细胞作为受体细胞，主要是因为植物体细胞具有全能性，且取材方便，而动物的体细胞不易表达全能性，故而对动物细胞来说，常选用全能性最高的受精卵为受体细胞。

一个质粒是否只能插入一种目的基因？提示：不是，质粒上有多个限制酶的切割位点，所以可以插入多种目的基因。基因工程常用的质粒是在天然质粒的基础上人工改造的。

必须是相同的黏性末端才能经DNA连接酶进行连接，而平末端则无这种要求。