DL;神经胶质瘤细胞;抗肿瘤;趋化

Fig.9PhotomicrographobservationsinculturedU251cells.Cellswμg/mL,(C)60μg/mL,andμL,5×10⁵个/mL种植于6孔培养板中，孵育24h。分设空白组，给药组。作用24h后，倒泡互相融合，形成一个空的胞质内大泡(Fig.10)。Fig.10PhotomicrographobservationsinculturedC6celμg/mL,(C)60μg/mL.and(D)100μg/mLfor24h.Magnification,×200.3.DL诱导人恶性胶质瘤细胞U87的死亡方式初探3.1倒置显微镜下观察DL对U87细胞形态学影响如图Fig.6所示，DL作用U87细胞24h后，细胞膜完整，细胞明显变圆，细胞质几乎完全被大大小小的空泡所占据；在高浓度(100μg/mL)时，这些空泡互相融合，形成一个空的胞质内大泡。细胞并未出现凋亡的典型形态特征，如：细胞皱缩和凋亡小体等。3.2荧光显微镜下吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)染色法观察DL对U87细胞形态学影响将消毒过的盖玻片预先置入6孔板，以10×10⁵个/mL种入细胞，常规培养24h,经不同浓度药物作用24h后，加入终浓度为40μg/mL的AO/EB染液染色1min;荧光显微镜下大大小小的空泡，细胞膜保持完整，无凋亡小体的出现(Fig.11)。Fig.11EffectofDLonthemicroscopyobservat(B)30μg/mL,(C)60μg/mLand(D)100μg/mLDLfor24h,×200.AOistakenupbybothviableandnonviablecellsandemitsgreen为了考察DL对U87细胞的周期阻滞作用，选取对数生长期U87细胞传代至100mL培养瓶中，待细胞铺满瓶底面积70~80%时换新鲜培养液，加药分别设以下组别：空白对照组、DL30、60μg/mL组，培养箱中继续孵育24h,然后收集各组细胞，流式细胞仪检测，每个样品采集10000个细胞，去除碎片和粘连细胞，采用CellQuestPro.3分析软件结合SPSS(13.0)统计软件包进行检验。实验结果显示(Fig.12、Fig.13):DL作用U87细胞24h,在0~60μg/mL范围内剂量依赖性的增加G₂/M期细胞的含量。而代表凋亡的亚二倍体峰含量只是轻微增加。Fig.12CellcycleanalysisofU87cellsbyflowcDNAcontentofU87cellsexposG₁,S,andG₂/Mwasdonewithcellquestpro.3software.Valuesweremeans±S.EM.ofthreeindependentexperiments.***P<0.001comparedwithcont4.1.1DL单独作用U87细胞后对细胞内活性氧含量(ROS)的影响30、60、100μg/mL组，培养箱中继续孵育5min、15min、30min、60min后，收集各组细Fig.14FormationofROSinU87cellstreatedwithdifferentconcentratiolevelsofROSweredeterminedwiththefluorescentprobeDCFH2-DA.Resultsrepresentmeans±S.Eindependentexperiments.**p<0.01,***p<0.001,significantdifferencesbetweendrugtreatedanduntre4.1.2抗氧化剂NAC和线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮(Rt)对DL响藤酮能显著抑制DL(30μg/mL)作用15min诱导的U87ROS产生。Fig.15EffectofNACandrotenoneon###p<0.001,ROSlevelsinDL-treaversuspretreatmentwithNAC[42]。接下来，我们进一步检测DL对细胞的线粒体膜电位的影响。流式细胞术结果表明，DL能剂量依赖性(Fig.16、Fig.17)和时间依赖性(Fig.18、Fig.19)降低U87细胞的线粒体膜电Fig.17DL-inducedlossofmitochondrialmembranepotential(MMFig.18FCManalysisofMMPafttreated3h、6h、9hrespectively.ThenumbersofthegatereFig.19DL-inducedlossofmitochondrialmembranepotential(MMP)inU87cedissipationofMMPinU87cells.Cellswereincubatedwith30μg/mLDLforindicatedtimeperiodonerepresentativeexperimentoutofthre4.2.2抗氧化剂NAC和线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮(Rt)对DL诱导的U87细胞线粒体膜电位降低的影响接下来得研究发现，预先用抗氧化剂NAC孵育U87细胞1.5h,并不能缓解DL诱导的U87细胞线粒体膜电位的降低。而预先用Rt孵育U87细胞1.5h,能够部分缓解DL诱发的U87细胞线粒体膜电位的降低。Fig.20EffectofNACandrotenoneonMMPi1h.Alternatively,cellswererepresentativeexperimentoutofthr30μg/mL、60μg/mL浓度的DL作用于U87细胞12h后，细胞DNA均有不同程度的损伤。沈阳药科大学硕士学位论文实验结果0cellsatdifferentconcentrationsw4.4DL对U87细胞内钙离子含量的影响钙离子在细胞死亡过程中发挥重要作用。当胞内钙离子浓度过高时会导致细胞死亡[43]。如图Fig.22所示：在100μg/mL时，DL能显著诱导U87细胞钙动员。为了进一步考察钙离子的来源，我们去除掉细胞外液中的钙离子(即将细胞外液换为不含钙离子的缓冲液，并加入0.5mM的EGTA)。实验结果表明，DL诱导的U87细胞钙动员主要来源于胞外钙离子。而且，预先用百日咳毒素(PTX)孵育16h后能显著抑制DL诱导的U87细胞钙动员，提示DL启动的U87细胞钙动员过程中有Gi蛋白的参与。Fig.22EffectofDLonU87cellcalciummobilization.DL-inducedCa²+fluxofUF2-inducedCa²⁺releaseandtheeffectof(100μg/mL)intheabsenceofintensityofthefluorescencewasmeasuredbytheuseoftheratiooftheabsorbanceat340to380nm.5.1DL对U87诱导迁移的作用ABFig.23DLinducedmigrationofU87cells.ACells(1×10⁶cells/mLofbindingmedium)wereaddedtotheupperpositivecontrol)wereaddedinthebottomwellsintheassay.Chemotaxisindexwformuladescribedinthemethods.*0.001comparedwithcellmigrationinresponsetocontrolmedium.BThecellsfilterwerephotographed(×400).Tab.2ChemotaxiswasdeterminedusingTab.2Chemotaxiswasdeterminedusingcompartment.DLwasusedat5werefromasingleexperiment(cellscountin3aseparateexperiment,***P<0.001comparedwithcellmigrationinre5.3DL诱导的U87细胞迁移能被PTX所抑制实验结果如图Fig.24所示，PTX预先作用能显著抑制fMLF及DL诱导的U87细胞趋化。提示，DL诱导的U87细胞趋化中有Gi蛋白的参与。Fig.24EffectofPTXonDL-inducedU87cellschemotaxis.CellswerepreincubatedwithorwiofPTXfor30minpriortochemotaxisassaywith5μg/mLDLor6.1DL对U87细胞FPRmRNA表达水平的影响如图Fig.25所示，DL(2.5、5、10μg/mL)处理U87细胞1或12小时，均不影响细胞Fig.25EffectofDLonFPRmRNAexpressionbyU87cells.CellsweretrconcentrationsofDLdidnotaffectFPRmRNAexpressionupto12结果如图Fig.26所示，fMLF(100nM)能显著诱导U87细胞VEGFmRNA的表达。非细mRNA的表达，且具有浓度依赖性。Fig.26EffectofDLonVEGFmRNAexpressionbyU87cells.CellswerepreincubatedwithD6.3DL能抑制fMLF诱导的U87细胞趋化性迁移 胞的趋化。Fig.27EffectofDLonfMLF-ininthelowerwellsofthechemotaxischamber.Cellswehthenwereplacedintheupperwmethods.*"P<0.001,comparedwithcellmigrationinresponsetocontrolmigrationcellswithDLpre-incubationwithcellswithoutDLpre-incubation.***P<0.001,comparedmigrationcellswithDLpre-incubationwith脑胶质瘤起源于脑组织的神经胶质细胞，是神经系统最常见的一种颅内恶性肿瘤，占颅内肿瘤50%左右，其发病率居各种肿瘤的第9位，死亡率居第2位。在全球，每年恶性脑胶质瘤无情地夺去18-60万中青年人的宝贵生命。罹患恶性胶质瘤的患者病情恶化迅速，平均目前，对脑胶质瘤的治疗仍以神经外科手术手段为主，然而，由于肿瘤呈浸润性生长，与脑组织无明显分界，难以通过手术彻底切除，因此手术后施行放射治疗和药物化疗等联合治疗就显得尤为重要。目前临床上应用的一线抗脑胶质瘤药物主要有亚硝脲类、顺铂、环磷酰胺及替莫唑胺等45],这些抗肿瘤药物多为细胞毒药物，缺少有效的选择性、并易产生耐药性，严重制约了这些药物在临床上使用，所以开发靶点清晰选择性高的新型治疗药物显得极为迫在实验室的前期药物筛选工作中发现，天然产物DL对多种肿瘤细胞都有明显的抑制增殖作用，尤其对于人恶性胶质瘤细胞U87的作用最为明显。抗肿瘤药物的体外药物敏感性试验是对其抗肿瘤谱筛查，探讨其体外抗肿瘤作用的重要方法。目前最常用的分析方法是细胞TJ905、U251及鼠胶质瘤细胞C6都有明显的抑制增殖作用，呈良好的时间依赖性和浓度依赖并且在光镜下观察DL对这几种胶质瘤细胞的细胞形态都有明显影响，DL作用细胞一定时间后，细胞变圆，贴壁不牢，细胞内出现大小不一的空泡，随着浓度的增加，细胞内的空泡增多，并融合、变大。这几种不同来源的胶质瘤细胞的形态学改变规律大致一致，只是不一直以来细胞死亡被分为细胞坏死和凋亡。随着近年来对于细胞死亡的深入研究，经典沈阳药科大学硕士学位论文实验讨论亡和非程序性细胞死亡两大类。非程序性细胞死亡即坏死，是细胞的被动性死亡，不能被细胞信号转导的抑制剂阻断47);程序性细胞死亡是细胞主动的死亡过程，能够被细胞信号转导的抑制剂阻断。过去十几年，程序性细胞死亡是caspase介导的细胞凋亡的同义语。近年来大量研究结果表明，细胞凋亡只是纷繁复杂的细胞程序性死亡机制中的一种。细胞具有多种死胞死掉，单一的死亡方式对于生命来说是十分危险的，因为一旦此通路受到抑制，后果将不目前多数化疗药物通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用，然而，有一些药物诱导的细胞死亡并不能简单的归于坏死或凋亡，在本研究中发现，DL诱导的U87细胞死亡就不同于坏死、凋亡，即细胞明显变圆，胞浆中出现许多大大小小的空泡、死亡过程中并没有出现凋亡小体及细胞皱缩、细胞凋亡特征性的亚二倍体峰期没有显著的增加诱导的U87细胞死亡类似自噬或paraptosis,但是现有的结果不能完全证明这个问题，需要进三.DL诱导人恶性胶质瘤U87细胞死亡机制初探前期实验已经发现DL有诱导人恶性胶质瘤细胞U87细胞死亡的作用，但是对于DL诱导U87死亡的机制还不清楚。本研究发现，DL诱导人恶性胶质瘤U87细胞毒作用与细胞内ROS水平密切相关。活性氧是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称，包括超氧阴离子(O₂)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(HO·)、一氧一方面，活性氧在正常细胞新陈代谢中不断产生，并且参与了正常机体内各种有益的作用，另一方面，在机体生长发育阶段或正常运转阶段，即使某种活性氧的产生多了一些，也会被产生增加，ROS清除或氧化生物大分子的损伤修复降低，或者二者同时发生，就会导致细胞物大分子损伤，最终导致细胞的死亡和组织的损伤50,51]。近年来，越来越多的证据表明，肿.瘤细胞的还原缓冲系统及抗氧化酶的活性相对有限。在持续的ROS应激会导致细胞的适应机制负担过重而耗竭其缓冲能力。因此，抗肿瘤药物诱导的ROS产生会进一步加重细胞的缓冲负担，达到其极限就会诱导肿瘤细胞的死亡。事实上，有研究认为活性氧的产生是许多化疗制剂发挥作用的重要模式。例如，三氧化二砷(As₂O₃),一种有效治疗急性早幼粒细胞白血另外，ROS的产生在一些抗肿瘤新药(如合成的维甲类药物42羟苯维甲胺、雌激素受体拮抗剂ZM1832780,阿霉素类衍生物和治疗前列腺癌药物BMD188)诱导的细胞毒作用发挥了重要作用，降低肿瘤细胞内拮抗ROS产生的抗氧化剂水平以促进胞内ROS的大量产生可能素诱导的白血病和神经母细胞瘤的死亡与细胞内活性氧的产生密切相关。因此，ROS的产生是一些抗肿瘤药物发挥作用的重要机制之一。酶标仪检测ROS实验表明，DL作用U87细胞后使得细胞内活性氧含量显著增加，提示在DL对U87细胞的诱导死亡作用初期，细胞内活性氧含量变化很可能是其主要触发因素之一。在生成ROS的细胞器中，线粒体是胞内活性氧的主要来源之一55]。而且，ROS的过量粒体膜电位实验结果显示，DL作用U87细胞后能显著降低U87细胞线粒体膜电位的水平，提示ROS大量蓄积也很可能正是使线粒体膜电位下降的原因之一。预先用抗氧化剂NAC孵育U87细胞1.5h,能部分抑制DL诱导的细胞活性氧产生，但不能明显缓解DL诱导的U87细胞线粒体膜电位的降低；预先作用线粒体呼吸链的抑制剂鱼藤酮能缓解DL诱导的MMP的降低，并不能完全抑制DL诱导的细胞ROS产生，因此，线粒体并不是DL诱导的细胞活性氧产生的唯一来源。这些结果表明，DL能够通过影响线粒体呼吸链复合物I来引起U87细胞活性氧的产生及线粒体膜电位的降低。同时活性氧是极强的氧化剂，它们在机体或细胞内聚集可造成各类生物大分子特别是因突变等一系列生物学后果。活性氧诱导的DNA氧化性损伤的主要方面是碱基结构的损伤。根据活性氧与DNA碱基的反应，大约能产生20多种不用的碱基加合物。OH·作为结构最简单、氧化性最强的活性氧，与组成DNA链的4种碱基反应活性最高。单细胞凝胶电泳实验提示，DL作用U87后能使细胞DNA造成损伤，提示DL作用U87细胞后产生大量ROS从而攻击细胞的DNA,导致细胞DNA断裂。当然，ROS除了可以由线粒体呼吸链介导产生，还可以通过一些氧化酶系介导产生，例如：NADH氧化酶系统、黄嘌呤氧化酶系统、环加氧酶和脱氧合酶系统、花生四烯酸环氧合酶系统等57]。所以，DL是否能够通过这些酶的活性而诱导ROS产生需要进一步研究。有研究结果表明，细胞内钙离子积聚也与细胞死亡有密切关系[58]。细胞内钙(钙离子)升高既是细胞损伤的后果，同时又是进一步器官损伤的始动因子，因此称细胞内钙离子升高为“细胞死亡的最终共同途径”。细胞外钙离子内流造成三磷酸腺苷(ATP)生成不足和生物膜去极化，导致控钙通道开放，由于生物膜的受损，线粒体、内质网膜等细胞内钙池释放钙离子也增加，即细胞内钙释放也增加。而此时钙泵由于ATP缺乏不能正常的将细胞内多余的钙离子泵出，细胞内钙池也不能重新储存钙离子，即生理状态下细胞对钙离子的调控机制在子进入细胞内，使细胞内钙离子增多，细胞死亡。同时细胞内线粒体功能明显降低，使三磷酸腺苷合成减少，使细胞膜上依赖三磷酸腺苷能量的离子后者又刺激线粒体对钙离子的摄取增加，线粒体内钙含量过高而导致细胞死亡5]。细胞内钙离子浓度增加可激活多种重要酶如蛋白酶、脂肪氧合酶A2,并促进自由基形成，故细胞内钙超载被认为是细胞死亡的最后共同通路。本研究发现DL作用U87细胞后可导致细胞内钙离子含量的升高，但当去除细胞外钙后此作用消失，说明DL启动的钙动员主要来自细胞外钙，所以DL诱导U87细胞内钙离子含量的增加可能是其诱导细胞死亡的机制之一。苯丙氨酰胺(formyl-Methionine-Leucyl-Phenylalanine,fMLF)的高亲和性受体。fMLF在皮克或低纳克浓度下就能激活FPR,介导白细胞趋化和钙动员等反应。尽管FPR最初发现于吞噬性白细胞，但是随后的研究发现，FPR的表达非常广泛。其在非造血细胞的表达及其内源性配体的发现提示该受体除了参与抗菌感染等宿主防御反应外，还具有更为广泛的病理生理功近年来对于FPR与脑胶质瘤的发生发展关系的研究很广泛，并取得了很大的进展。研究表明：a)FPR在高度恶性且血管丰富的人恶性胶质瘤组织及部分恶性胶质瘤细胞系WHOⅢb)利用小RNA干扰技术(smallinterferenceRNA,siRNA)抑制胶质瘤细胞FPR表达后，U87细胞增殖速度减缓，促血管生成因子VEGF等分泌减少，瘤细胞在裸鼠体内形成的移植瘤的生长、演进明显减弱(15;c)经鉴定，活体肿瘤组织坏死灶和坏死瘤细胞上清液中存在FPR激动剂样物质，且该物质能与FPR结合并激活FPR(17;d)表达于胶质瘤细胞的FPR被激活后，能介导肿瘤细胞的迁移和增殖，还可以通过细胞内信号转导途径活化转录因子NF-kB、STAT3和HIF-1α,进而上调VEGF(vascularendotheligrowthfactor)和IL-8的基因表达，促进血管的生成61];e)FPR的活化还能通过转活表皮生长因子受体(EGFR)而促进肿瘤细胞的发生和演进过程中可能起至关重要的作用。因此，抑制FPR表达和(或)功能可能是恶性胶质瘤治疗的途径之一，寻找具有抗肿瘤活性的新型合成化合物尤为重要。所以本文首先考察了DL对于U87细胞FPRmRNA的表达的影响，实验结果表明，DL作用U87细胞后对于细胞FPRmRNA的表达没有显著的影响，说明DL不能直接作用于细胞表面的FPR。但是DL对于FPR受体激动剂fMLF激活受体后是否能影响FPR的功能及信号转导还不清楚，于是本文又进行了进一步的研究。“肿瘤生长于转移依靠血管生成”的观点。大量的研究表明，肿瘤的生长依靠血管新生，转移很少发生在血管新生之前，肿瘤的转移及其在转移部位的生长也依靠肿瘤组织的血管新生。肿瘤新生血管有重要作用：输送氧气、营养，转运代谢产物，满足肿瘤组织无限生长的需要；内皮细胞本身对肿瘤细胞有旁分泌刺激作用，它产生生长因子、细胞因子促进瘤细胞生长转移；肿瘤的血管化使癌细胞易于接近血管系统；并且肿瘤血管的结构缺陷更有利于肿瘤的血管播撒。目前已普遍认为新生血管的生成与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。尤其，血管皮细胞转异性有丝分裂原。它是一种分泌性糖蛋白，可由肿瘤细胞，肿瘤间质中的巨噬细胞，成纤维细胞，淋巴细胞等分泌，作为胞外信息分子与靶细胞上的受体结合，通过胞内信号传导途径使靶细胞产生多种生物效应，包括特异性地诱导内皮细胞分裂增殖；增加血管通透性，促进血浆蛋白渗出形成新基质；诱导内皮细胞合成大量的蛋白水解酶，降解血管基底膜，在肿瘤血管生长的各个环节中均起重要作用FPR被激活后，U87细胞内表达的VEGF显著增加，而DL能显著抑制fMLF诱导的U87细胞VEGFmRNA的表达。虽然还需要进一步的实验研究，但目前的结果至少表明DL具有抑制胶质瘤血管生成的潜在作用。恶性肿瘤的浸润、转移被认为是临床治疗失败和病人死亡的主要原因。因此，现今治疗恶性肿瘤最困难的地方，除了其无法被早期侦测发现外，对于临床上如何阻断后续癌细胞的侵袭与转移，仍缺乏有效且副作用低的治疗方法。因此，如果药物在抑制肿瘤细胞增殖的同时能够抑制其转移，将有助于药物的抗肿瘤效果。趋化可以通过刺激肿瘤细胞的定向迁移而与肿瘤细胞的侵袭与转移密切相关。因此，本文考察了DL对FPR激动剂fMLF诱导的U87细胞趋化的影响。实验结果表明，非细胞毒浓度的DL能浓度依赖性抑制fMLF诱导的U87细胞趋化。由于U87细胞既表达FPR又表达FPRL1,但是FPRL1不能介导fMLF诱导的U87沈阳药科大学硕士学位论文实验讨论诱导的U87细胞趋化的抑制作用并不是其影响细胞随机迁移的结果。因此，用于FPR,进而影响其介导的趋化功能。并且进一步的研究表明，DL能抑制fMLF诱导的U87细胞钙动员，表明了DL能影响由fMLF介导的FPR的信号转导。以上研究结果提示DL不能直接激活FPR,但能特异性干扰FPR的功能及其信号转导。总之，本研究首次证明了天然产物DL可以有效抑制胶质瘤细胞的趋化，对胶质瘤血管生成具有潜在的治疗作用，还可以显著下调新型抗胶质瘤靶点FPR的表达，提示DL具有开发成能够介导细胞趋化的受体有很多，趋化受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP蛋白偶联的跨膜受体(GPCR),至少包括：趋化受体(FPR、FPRL1、FPRL2)、趋化因子受体、表皮生长因子受体、表皮生长因子受体家族的神经调节素受体(ErbB4CYT-1)、胰岛素样生长因子受体和神经生长因子受体(NGF-R)等。近年来研究表明：趋化受体不仅在保护宿主、清除病原因子、炎症反应、过敏反应、免疫细胞的发育、分化及免疫系统的自身稳定等方面起作用，而且在肿瘤的形成及转移、移植免疫排斥、中枢神经系统神经网络的发育、心血管我们的研究表明DL在细胞毒浓度下能够杀伤U87细胞，而趋化实验结果表明，在非细胞毒浓度的DL还可以诱导肿瘤细胞迁移，这样就可以使肿瘤细胞由DL的低浓度区趋化到高浓度区，进而发挥其杀伤作用。但此作用可被PTX所抑制，说明这个过程有Gi蛋白的参与。总之，非细胞毒浓度的DL能够诱导U87细胞趋化至其高浓度区，这对于更好的发挥其1.DL能显著降低多种胶质瘤细胞的成活率，包括人恶性胶质瘤细胞U87、TJ899、TJ905、U251及大鼠胶质瘤细胞C6,且具有浓度依赖性和时间依赖性。2.DL对人恶性胶质瘤U87细胞的死亡方式研究表明，DL诱导的U87细胞死亡方式不3.DL诱导的人恶性胶质瘤U87细胞的死亡机制可能与增加细胞活性氧释放、降低线粒4.非细胞毒浓度的DL诱导的U87细胞迁移主要是趋化，但有轻微化学激活作用，此5.非细胞毒浓度的DL能特异性的抑制FPR的功能及信号转导。[1]EntschladenF,DrellTLT,LangK,JosephJ,ZaenkerKS.Tumour-cellmignavigationbyneurotransmitters.Lancet.Oncol.2004;5(1):254-258.[2]FeldnerJC,BrandtBH.Cancercellmotilireorganization.Exp.CellRes.2002;272(2):93-108.[3]FaithGD,SallyF,Tameageandtumorhistologicaltype:J.Neurosurg.1998;19(1):1973-1991.[4]BellinzonaM,RoserF,MatthiesC.Biopolymermediatedsuraminchemotherapyexperimentalbraintumours.Acta.Oncol.2004;4(3):259-263.[5]AsherE,PayneCM,Berelectrophresis,lightmicroscopyandelectronmicroscopy.IⅡ.Inductionofnon-classicapop("para-apoptosis")bytritiatedthymidine.Leuk.Lymphoma.1995;19(2):107-1[6]KokSH,ChuiCH,LamWS,ChenJ,TangJC,LauFY,ChengGY,WongRS,Choncarcinomacellsbytwosyntheticcantharidinanalogues.IntJMolMed.2006[7]LorenzenJ,ThieleJ,FischerR.ThemummifiedHodgkincell:cellAm.J.Pathol.1997;151(6):1629-1638.[9]MargaretE,TomeAF,BakerGP.Catalase-overexpressingthymocytesareresistanttoglapoptosisandexhibitincreasednettumorgrowth.CancerRes.2001;16(6):2766-2773.[10]SperandioS,BellDI,DaleE.BredesenR.ACellBiology.2000;2(97):14376.[11]DmitryB,MagdalenaJ,StevenS.MitochondrialROS-inducedROSrelease:AnupdateanBiophys.Acta.2006;1757(1):509-517.[12]ButlerR,MitchellSH,TindallDJ.Nonapoptoticcelldeathassociatcellsviatheperoxisomeproliferators-activatedreceptorgammaligand.Ce[13]MurphyPM,OzelikT,KenneyRT.AstructuralHomologueoftheN-Formylpeptidereceptor.J.Biol.Chem.[14]刘宏，卞修武，陈代伦，赵雯，陈剑鸿，冯玉慧，徐承平.诺帝对人恶性胶质瘤裸鼠原位移植瘤FPR、VEGF表达的影响及意义.中国微侵袭神经外科杂志.2007;12(2):72-75.[15]ProssnitzER,YeRD.TheN-formylpeptidereceptor:amodelforthestudyofchemoattractantreceptorstructureandfunction.Pharmacol.Ther.1997;74[16]LeYY,HuJY,GongW,ShenW,LiB,DunlopNM,HalversonD,BlairDGWanfunctionalformylpeptidereceptorsbyhumanastrocytomacelllines.J.Neuroimmunol.2000;1[17]LeYY,PhilipM,WangJM.Formyl-peptidereceptorsrevisited.TrendsImmu[18]HuangJ,KeqiangC,GongWH,YeZ,LeYY,Biangliomacells:Atacticfortumorprogression.CancerLett.200[19]ZhouY,BianXW,LeYY,GongWH,HuJY,ZhangX,WangLH,IribarrenFarrarW,WangJM.FormylpeptidereceptorFPRandtherapidgrowthofmCancerI.2005;97(2):823-835.[20]朱军，孙泽林，戚晓渊，李建珉，程爱国.腺病毒介导的p16基因对TJ899细胞系活性的影响.中华神经外科疾病研究杂志.2004;3(4):341-343.[21]夏之柏，齐铁伟，陈晓雷，张恒，石忠松，陈昆，黄正松.三氧化二砷对人脑胶质瘤生长的抑制作用.[22]ManuelK,UlrikeM,StefanieK,HaukeD,NinaA,KirstenH,StefanW,StefanRJ,Schelle27inducesdifferentiationofneuralC6-precu364(3):483-487.cells.Biochem.Biophys.Res.Comm.1998;249(3):817-821.[24]DejanB,SuzanaP,PetarR.Analysisofcycloheximide-inducedapoptosisinhumicroscopyusingannexinV/propidiumiodideversusac30(11):924-932.[25]WesierskaG,SchlofferD,GueorguievaM,SkladanowskiA.Increasedsusceptibilityofpoly(polymerase-1knockoutcellstoantitumortriazoloacridoneC-1305isassociatecyclearrest.CancerRes.2004;64(4):4487-4497.[26]WojciechowskiJ,HorkyM,GueorguievaM,WesierskaGJ.Rapidonsetofnucleolardisintegrationprecedingcellcyclearrestinroscovitine-inducedapoptosisofhumanMCF-7breastcancercells.Int.J.Cancer.200[27]马锐，何红梅，袁媛.大蒜素与细胞周期特异性化疗药联合应用抗肿瘤的实验研究.中国肿瘤临床.2005;12(9):1129-1132.[28]MagnusJH,RolandM,SaoriM,HiroyuAlexandrJ,EskilE.Calcium-inducedgenerationofreactiveoxygmediatedbypermeabilitytransition.FreeRadicalBio.Med.2008;1(45):284-29[29]PatriciaP,GaelR,NeusV.ThepthroughgenerationofROSandNoxaactivationindependentofp53status.Blood.2006;4(10):257-264.[30]WeissJN,KorgeP,HondaHM.RoleofthemitochondrialpermRes.2003;93(4):292-301.[32]SinghNP,MccoyMT,TiceRR,SchneiderEL.Asimpletechniqueforquantitationofdamageinindividualcell.Exp.CellRes.1988;175(1):184-191.[33]MariaV,MichaelP.ComparisonofDNAdamageinperipheralbloodandspleenIymphocsingle-cellgelassay.MutatRes.1997;379(2):263-269.[34]DavidAS,WanderleyS,MarleneB,LiZ,HongGL,SilviaNJ.Prpyrophosphataseinacidocalcisomesoftrypanosomacruzi.J.Biol.Chem.1998;273(34):22151-22158.[35]MegganC,JiL,AllanK,JulieLH.Humanpreceptors.ExpHematol.2005;33(1):73-84.[36]JoshiPG,Mishra597(4):108-113.[37]HallettMB,HodgesR,CadmanM,BlanchfieldH,formeasuringandmanipulatingfreeCa²+inthecy[38]RisomL,DybdahM,BornholdtJ,VogelU,WallinH,MullerP,Logeneexpressioninthemouselungaftershort-termexposCarcinogenesis.2003;24(11):1847-1852.[39]MethyD,Bertrandaexpressionincerebrale[40]ChenDL,PingYF,YuSC,ChenJFPRrestrainsxenografttumorsbyimpairingtheangiogenicpotegliomacells.Biochem.Biophys.Res.Commun.2009;381(3):4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