基因工程的基本操作程序第2课时课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程第2节

基因工程的基本操作程序人教版·选择性必修3基因表达载体的构建获得目的基因后直接转入受体吗？

不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。获得目的基因后直接转入受体吗？基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代;使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。1、基因表达载体的作用质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。供目的基因插入载体中便于重组DNA的筛选能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上2、基因表达载体的组成3.基因表达载体构建的流程同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割DNA连接酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因限制酶切割位点质粒重组DNA分子限制酶限制酶限制酶限制酶DNA连接酶质粒重组DNA分子目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。3.基因表达载体构建的流程图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因(一般不全破坏)、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。基因表达载体的构建(核心)1.区分启动子和起始密码子,终止子和终止密码子启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。2.区分载体、表达载体、重组质粒载体≠表达载体二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。补充知识：基因结构-----原核生物基因编码区上游编码区下游启动子终止子①功能：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段，调控遗传信息的表达。能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。编码区：非编码区：②组成：编码区上游与编码区下游。上游有启动子，下游有终止子。编码区非编码区非编码区基因RNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录终止转录补充知识：基因结构-----原核生物基因编码区上游编码区下游启动子终止子编码区非编码区非编码区AGGTCACGTCGATCGTCCAGTGCAGCTAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCGAUCG转录mRNA翻译多肽链补充知识：基因结构-----真核生物基因编码区上游编码区下游启动子终止子编码区非编码区非编码区内含子外显子编码区：非编码区：外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。真核生物基因中的非编码序列：包括非编码区和内含子基因不编码蛋白质,能调控遗传信息表达补充知识：基因结构-----真核生物基因编码区上游编码区下游启动子终止子编码区非编码区非编码区RNA聚合酶转录mRNA前体加工（剪切、拼接）成熟mRNA翻译多肽链真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNA前体，需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。补充知识：基因结构-----真核生物基因编码区上游编码区下游启动子终止子编码区非编码区非编码区转录mRNA前体加工（剪切、拼接）成熟mRNADNA聚合酶逆转录酶逆转录复制单链DNAcDNA不含非编码序列。即不含非编码区和内含子基因通常是有遗传效应的DNA片段原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都有能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码非编码序列=非编码区原核基因：非编码序列真核基因：=非编码区+内含子成熟mRNA相应酶去除内含子转录翻译真核基因：编码区（外显子+内含子）多肽链前体mRNA蛋白质加工如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？提示：一般不能产生原来的蛋白质原因：①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）提取如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质吗？mRNA单链逆转录酶DNA单链DNA双链酶cDNA成熟mRNA去除内含子转录真核基因：编码区（外显子+内含子）前体mRNA相应酶提示：把真核基因的cDNA导入到原核细胞中表达。（具体做法，如图）利用转基因大肠杆菌生产药物的实验思路原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。将目的基因导入受体细胞基因表达载体受体细胞导入动物植物微生物将目的基因导入不同受体细胞的方法有何不同？将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：方法植物细胞：动物细胞：微生物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。（1）花粉管通道法（我国科学家独创）②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因适用生物：开花植物第三步：将目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞受体细胞：受精卵花粉管通道法的过程：P811.将目的基因导入植物细胞冠瘿瘤农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等(2)农杆菌转化法P811.将目的基因导入植物细胞为什么农杆菌容易感染双子叶植物？科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有(2)农杆菌转化法P811.将目的基因导入植物细胞农杆菌特点：·能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。·农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。①载体：②受体细胞：农杆菌Ti质粒主要是双子叶植物和裸子植物随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功(2)农杆菌转化法P811.将目的基因导入植物细胞(2)农杆菌转化法构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒表现出新性状的植株导入植物细胞植物细胞将目的基因插入染色体DNA中目的基因Ti质粒T-DNA含重组Ti质粒的农杆菌转入农杆菌③过程农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因农杆菌基因表达载体构建转入导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状该过程经过____次拼接、____次导入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：______________________________________________________________③第一次导入：__________________________________④第二次导入：__________________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上

农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）拓展2、

农杆菌转化法（采用最多）基因表达载体构建Ti质粒目的基因农杆菌转入导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？

得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞2.农杆菌转化法（采用最多）④

农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法（最常用）实验具体操作①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片（即外植体），与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生植株。受体细胞：体细胞②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等受体细胞：受精卵第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入动物细胞受精卵构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物①

导入方法：②

受体细胞：③

过程：显微注射法为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①

体积大，易操作。②

全能性高，易培养成完整个体。第三步：将目的基因导入受体细胞4.目的基因导入微生物细胞①

常用方法：②

受体细胞：Ca2+处理法常用原核细胞（大肠杆菌应用最为广泛）目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。优点：生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。Ca2+感受态细胞吸收第