多抗制备方案1

多抗制备方案[1]一、引言多克隆抗体（多抗）在生物学研究、诊断试剂开发、治疗药物研发等领域具有广泛的应用。多抗是由多种不同的B淋巴细胞克隆产生的针对特定抗原不同表位的抗体混合物。制备高质量的多抗对于满足各种实验和应用需求至关重要。本方案旨在详细介绍多抗制备的各个环节，包括抗原选择与处理、动物选择与免疫、血清采集与处理、抗体纯化与鉴定等，以确保获得高效价、高特异性的多抗。

二、抗原选择与处理

（一）抗原选择1.纯度要求尽量选择高纯度的抗原，以减少杂质对免疫反应的干扰。一般要求抗原纯度达到95%以上。例如，对于蛋白质抗原，可通过亲和层析、离子交换层析等方法进行纯化。2.完整性抗原应保持其天然的结构和活性。避免过度处理导致抗原变性，影响免疫效果。对于一些对温度、pH敏感的抗原，操作过程中要注意条件的控制。3.免疫原性选择具有良好免疫原性的抗原。通常，分子量较大（一般大于10kD）、结构复杂的蛋白质等更容易引发免疫反应。例如，一些病毒蛋白、重组蛋白等常被用作免疫原。4.与研究目的相关抗原应与研究或应用的具体目标紧密相关。如果是用于检测某种疾病标志物，应选择该疾病标志物对应的天然或重组抗原。

（二）抗原处理1.偶联载体蛋白（若需要）对于一些小分子抗原（如半抗原），需要将其偶联到载体蛋白上，以增强免疫原性。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）等。偶联方法可采用化学交联法，如戊二醛法、碳化二亚胺法等。以戊二醛法为例，将抗原与载体蛋白按一定比例混合，加入适量的戊二醛，在一定pH和温度条件下反应一段时间，然后通过透析等方法去除未反应的试剂。2.乳化处理（用于不完全福氏佐剂免疫）如果使用不完全福氏佐剂进行免疫，需要将抗原与佐剂充分乳化。取适量的不完全福氏佐剂置于无菌容器中，缓慢加入抗原溶液，边加边用注射器反复抽吸，使两者充分混合形成油包水乳剂。乳化程度可通过观察乳剂的稳定性来判断，好的乳剂在室温下放置一段时间后不会分层。

三、动物选择与免疫

（一）动物选择1.常用动物常用的制备多抗的动物有兔子、山羊、小鼠等。兔子因其体型适中、易于饲养管理、免疫反应强等优点，是最常用的动物之一。2.动物健康状况选择健康、无特定病原体（SPF）的动物。动物应外观精神良好，无明显的疾病症状，如发热、消瘦、腹泻等。购买动物时，要选择正规的供应商，并索取动物的健康检测报告。3.动物年龄与体重兔子一般选择体重在23kg，年龄在36个月的为宜。小鼠体重一般在1822g，年龄在68周。合适的年龄和体重有助于保证动物具有良好的免疫反应能力。

（二）免疫程序1.首次免疫将乳化好的抗原（含佐剂）通过皮下多点注射的方式注入动物体内。兔子一般在背部两侧、颈部等部位进行多点注射，每点注射量约0.10.2ml，总注射量根据动物体重调整，一般为12ml。首次免疫使用不完全福氏佐剂，以增强抗原的免疫原性。2.加强免疫在首次免疫后的12周进行第一次加强免疫。加强免疫的抗原剂量可适当增加，一般为首次免疫剂量的1.52倍。加强免疫仍使用不完全福氏佐剂。之后每隔12周进行一次加强免疫，共进行35次加强免疫。随着加强免疫次数的增加，可逐渐减少佐剂的用量，最后一次加强免疫可使用不加佐剂的抗原溶液，称为"冲击免疫"，以提高抗体效价。3.免疫监测在免疫过程中，定期采集动物血液，检测血清中抗体的效价。常用的检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验等。根据抗体效价的变化调整免疫程序。当抗体效价达到满意水平（如ELISA检测OD值大于一定阈值）时，可进行血清采集。

四、血清采集与处理

（一）血清采集1.采血前准备在采血前，动物需禁食12小时左右，以减少血液中血脂等成分的干扰。准备好无菌的采血器材，如注射器、针头、采血管等，并确保其经过严格的消毒处理。2.采血方法兔子一般采用耳静脉采血法。将兔子固定，用酒精棉球擦拭耳静脉部位，使其血管扩张。然后用合适的针头刺入耳静脉，缓慢抽取血液。一般可采集1020ml血液，根据动物体重和健康状况适当调整采血量。小鼠可采用眼眶后静脉丛采血法或心脏采血法。眼眶后静脉丛采血时，用特制的采血器从眼眶后静脉丛抽取血液，一般可采集0.20.5ml血液。心脏采血则需要在无菌条件下，用注射器直接刺入小鼠心脏抽取血液，采血量相对较多，但操作要求较高，且对动物损伤较大。3.血液处理将采集的血液置于无菌采血管中，室温下静置12小时，使血液自然凝固。然后将采血管放入37℃温箱中孵育12小时，以促进血块收缩，释放血清。待血块完全收缩后，用离心机以30004000rpm离心1015分钟，分离出血清。将血清转移至无菌离心管中，标记好动物信息、采血日期等。

（二）血清处理1.除菌过滤采用0.22μm或0.45μm的滤膜对血清进行除菌过滤，去除血清中的细菌、支原体等微生物。过滤过程应在无菌条件下进行，可使用无菌过滤器和注射器等装置。2.分装保存将除菌后的血清分装到无菌的离心管或冻存管中，每管分装量根据实际需要确定，一般为0.51ml。血清可在20℃或80℃保存。长期保存建议在80℃，以防止反复冻融导致抗体效价降低。在使用前，应避免血清反复冻融次数过多，一般不超过34次。

五、抗体纯化

（一）粗提1.硫酸铵沉淀法利用不同浓度硫酸铵沉淀不同分子量的蛋白质。将血清缓慢加入到饱和硫酸铵溶液中，边加边搅拌，使硫酸铵终浓度达到一定值（如50%饱和度）。在4℃下搅拌12小时，然后以30004000rpm离心1015分钟，收集沉淀。沉淀用适量的缓冲液（如PBS）溶解，再重复上述操作，使硫酸铵终浓度达到80%饱和度，离心收集沉淀，此沉淀即为粗提的免疫球蛋白。2.辛酸硫酸铵法在血清中加入辛酸，使辛酸终浓度达到0.06mol/L，在4℃下搅拌12小时。然后加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度达到33%饱和度，搅拌30分钟后离心，收集上清液。上清液再加入硫酸铵，使其终浓度达到50%饱和度，离心收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，得到粗提的抗体。

（二）进一步纯化1.离子交换层析选择合适的离子交换树脂，如DEAESepharose或CMSepharose。将粗提的抗体上样到离子交换柱中，根据抗体与树脂的电荷相互作用进行分离。用不同浓度的盐溶液（如NaCl溶液）进行梯度洗脱，收集含有目标抗体的洗脱峰。通过检测洗脱液的蛋白浓度（如Bradford法）和抗体活性（如ELISA法）来确定目标洗脱峰。2.亲和层析如果已知抗原的特性，可制备抗原亲和层析柱。将抗原偶联到琼脂糖等载体上，装柱后将粗提抗体上样。抗体与抗原特异性结合，然后用适当的洗脱液（如低pH缓冲液）将抗体从柱上洗脱下来，得到高纯度的抗体。亲和层析具有很高的特异性，能有效去除杂质蛋白。3.凝胶过滤层析利用不同分子量的蛋白质在凝胶过滤介质中的渗透速度不同进行分离。选择合适的凝胶过滤柱，如SephacrylS200等。将经过初步纯化的抗体上样到柱中，用缓冲液洗脱，根据蛋白质分子量大小顺序依次流出，收集目标抗体峰，进一步去除聚合体等杂质，提高抗体的纯度和均一性。

六、抗体鉴定

（一）效价测定1.ELISA法用包被抗原包被酶标板，每孔加入适量的包被液，4℃过夜。然后用封闭液封闭酶标板，37℃孵育12小时。将不同稀释度的抗体血清加入酶标板孔中，37℃孵育12小时。洗涤后加入酶标二抗，37℃孵育12小时。再次洗涤后加入底物显色，用酶标仪测定OD值。以OD值为纵坐标，抗体稀释倍数为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算抗体效价，一般以抗体血清能产生明显显色反应的最高稀释倍数作为效价。2.免疫比浊法如果抗体能与相应抗原形成沉淀复合物，可采用免疫比浊法测定效价。将一定浓度的抗原与不同稀释度的抗体血清在特定条件下混合，通过检测混合液的浊度变化来计算抗体效价。

（二）特异性鉴定1.交叉反应试验用与免疫抗原结构相似的其他抗原包被酶标板，进行ELISA检测。观察抗体血清是否与这些交叉抗原发生反应。如果交叉反应率很低（一般要求交叉反应率小于5%），则说明抗体具有较高的特异性。2.Westernblot鉴定将免疫抗原和其他相关抗原进行SDSPAGE电泳分离，然后转印到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。用抗体血清进行孵育，再用酶标二抗孵育，通过化学发光或显色底物显色检测抗体与抗原的结合情况。如果抗体只与免疫抗原产生特异性条带，而不与其他无关抗原条带反应，则表明抗体特异性良好。

（三）纯度鉴定1.SDSPAGE电泳将纯化的抗体进行SDSPAGE电泳，根据蛋白条带的数量和位置判断抗体的纯度。如果在还原条件下只出现一条清晰的蛋白条带，说明抗体纯度较高。2.高效液相色谱（HPLC）利用HPLC分析抗体的纯度。通过检测抗体在色谱柱上的保留时间和峰形等，确定抗体的纯度和均一性。HPLC能更准确地检测抗体中的杂质成分和含量，是一种常用的纯度鉴定方法。

七、注意事项

1.实验操作规范整个多抗制备过程要严格遵守无菌操作原则，防止微生物污染。所有实验器材要经过严格消毒处理，实验人员要佩戴口罩、手套等防护用品。2.动物福利在动物饲养和免疫过程中，要给予动物良好的生活条件和适当的照顾。按照动物饲养管理规范进行喂养，定期检查动物健康状况。在免疫和采血过程中，尽量减少动物的痛苦，避免过度伤害动物。3.抗原质量控制确保抗原的质量稳定，每次免疫使用的抗原应保持一致性。对于易变质的抗原，要注意保存条件，避免反复冻融。在抗原处理过程中，要严格按照操作规程进行，保证抗原的活性和免疫原性。4.免疫反应监测定期监测免疫动物的抗体效价和健康状况。根据抗体效价变化及时调整免疫程序，同时注意动物在免疫过程中是