（高清版）DB12∕T 504-2014 水稻转基因成分筛查方法

DB12DB12/T504—2014水稻转基因成分筛查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedrice2014-04-22发布2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布本标准2014年04月首次发布。1本标准规定了水稻中转基因成分定性PCR筛查的术语本标准适用于水稻及其制品中SPS基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因的定性PCR筛查检测。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有GB/T6682分析实验室用水规格NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样SPS基因SPSgeneCaMV35S启动子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS终止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneBt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene），NPTII基因NPTIIgene来源于大肠杆菌（Escherichiacoli），编码新霉HPT基因HPTgene来自大肠杆菌或链球菌（Streptomyceshygroscopicus编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin24检测方法4.1.1实验用水为重蒸馏水或符合GB/），注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.），）：）：），用水稀释成1×TAE。4.1.9加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基4.1.13引物：水稻内标准基因和转基因水稻SPS287bpCaMV35S35S-F：5′-GCTCCTACAAATGCC35S-R：5′-GATAGTGGGATTGTGNOSNOS-F：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGNOS-R：5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTABtNPTIINpt-F：5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’Npt-R：5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’289bpHPThpt-F：5’-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-3’hpt-R：5’-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3’472bp按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定的执行。按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定的执行。R水——2.5µL25mmol/L氯化镁溶液2.0µL0.5～2.5µL40.2～0.5µmol/L0.5～2.5µL0.025U/µL 2.0µL25.0µL检测反应体系中，上下游引物分别是Bt-F和Bt-R，引物系中，上下游引物分别是Npt-F和Npt-R，引物终浓度分别为0.2µmol/L；HPT基因PCR检测反应SPSNOSBtNPTIIHPT4.3.5.1.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。以非转基因水稻基因组DNA作为阴性对照；以含有SPS、CaM5各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12µLPCR产物与3µL加样缓冲液混件下电泳检测。增片段是否为目的DNA片段，按照4.3.8和4.3.9的规定执行。致，而在阴性对照中仅扩增出内标准基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明P常。否则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。S基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因成分。结果表述为“试样中未检测出CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因，检测结果为阴性”。S启动子、NOS终止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因中任何一个得到扩增，且扩增片段大小与预期A.2CaMV35S启动子PCR扩增产物核苷酸序列