干细胞的体外培养职业教育医学生物技术专业教学课件

职业教育医学生物技术专业教学资源库干细胞的体外培养职业教育医学生物技术专业教学资源库一、技术原理职业教育医学生物技术专业教学资源库（一）技术原理基本原则：促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。有饲养层（feederlayer）培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤维细胞（MouseEmbryoFirbroblasts,MEF）制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。职业教育医学生物技术专业教学资源库二、基本过程职业教育医学生物技术专业教学资源库饲养层细胞制备或条件培养基制备胚胎的制备和培养胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的鉴定冻存与复苏细胞克隆形态碱性磷酸酶检测核型的鉴定分化能力的观察嵌合能力的测定职业教育医学生物技术专业教学资源库1、饲养层细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：取孕12.5-14.5d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。STO细胞：按照一般已建细胞系培养方法。DMEM加10%小牛血清作为培养液。采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复苏。职业教育医学生物技术专业教学资源库MEF和STO的优缺点：MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比STO强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，STO则可长期传代培养。MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。职业教育医学生物技术专业教学资源库胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或STO的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。职业教育医学生物技术专业教学资源库2、饲养单层制备MEF或STO连成一片，以含10μg/ml丝裂霉素培养液370C作用2-3h（如细胞层较薄，也可缩短至30min-1.5h），或γ射线照射（剂量为30-100Gy）。弃含丝裂霉素培养液，PBS洗5次，γ射线处理者不用清洗。消化细胞，制备悬液种植至用0.1%明胶处理过（0.1%明胶水溶液覆盖培养瓶表面，室温2h以上）的培养瓶，种植细胞数：MEF7.5×104-105个/cm2，STO为5×104个/cm2。培养至细胞连成一片没有间隙（中间可补加处理过的细胞），制备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细胞培养液。职业教育医学生物技术专业教学资源库观察：好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。职业教育医学生物技术专业教学资源库3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓度为1000U/ml。Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子DIF。收集培养72h的培养液，过滤除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干细胞培养液，再添加8-10%胎牛血清。年龄2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养液，过滤除菌，用前6份+3份胚胎干细胞培养液+1份胎牛血清。职业教育医学生物技术专业教学资源库4、胚胎干细胞的分离和培养（1）培养液配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为（4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。使用前还要添加β-巯基乙醇（0.1mmol/L）或单硫甘油（0.15mmol/L）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。职业教育医学生物技术专业教学资源库血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。职业教育医学生物技术专业教学资源库（2）胚胎干细胞的分离小鼠：母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层细胞，获得内细胞团（innercellmass，ICM），并分散为3-4个细胞在一起的细胞团职业教育医学生物技术专业教学资源库（3）胚胎干细胞培养有饲养层细胞培养：将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养2d后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3min加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。无饲养层培养：明胶包被培养板，条件培养基。已建系胚胎干细胞：将已培养2-3d生长旺盛干细胞消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照1：3或1：6比例转钟。职业教育医学生物技术专业教学资源库注意事项：最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。培养条件要始终如一。为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。职业教育医学生物技术专业教学资源库（4）培养结果hES细胞集落（×10）胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。职业教育医学生物技术专业教学资源库小鼠胚胎生殖细胞的相位衬度图像职业教育医学生物技术专业教学资源库小鼠胚胎生殖细胞培养皿含有数百个小鼠胚胎生殖细胞群的培养皿。每一个红色染色的斑点代表一个由数百或数千个干细胞组成的个体集落。职业教育医学生物技术专业教学资源库5、胚胎干细胞的冻存和复苏冻存液：胚胎干细胞培养液+10%-15%DMSO。冻存细胞密度：106-107个/ml冻存与复苏方法同普通细胞。LIF条件培养基培养的细胞，仍然用不含LIF的胚胎干细胞培养液冻存。职业教育医学生物技术专业教学资源库三、胚胎干细胞的鉴定职业教育医学生物技术专业教学资源库1、ES细胞生物学特性（1）ES细胞形态结构及核型ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了二倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。

职业教育医学生物技术专业教学资源库（2）ES细胞生长特性ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。

ES细胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。职业教育医学生物技术专业教学资源库（3）ES细胞的高度分化潜能ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”

“囊状胚体”

细胞分化物。ES细胞可进行诱导分化

*用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞，

*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。

*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。

*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。职业教育医学生物技术专业教学资源库

（4）碱性磷酸酶的表达

许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。职业教育医学生物技术专业教学资源库

（5）胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达

早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA-1的表达。小鼠SSEA-1的表达自8细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。职业教育医学生物技术专业教学资源库2、ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：

①形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；

②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞系混杂的集合体、具有三个胚层组织；

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③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；

④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。职业教育医学生物技术专业教学资源库3、ES细胞的鉴定--细胞的形态结构--核型分析--碱性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫荧光标记--分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成试验核移植试验职业教育医学生物技术专业教学资源库

（1）ES细胞形态学鉴定依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。职业教育医学生物技术专业教学资源库

（2）核型分析

ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验职业教育医学生物技术专业教学资源库

（3）碱性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在碱性条件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚钠水解，产生α-奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。步骤：生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室温5-10min→水洗10min→复染（甲基绿等）10min。结果：未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。对照：以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。

职业教育医学生物技术专业教学资源库职业教育医学生物技术专业教学资源库（4）胚胎干细胞特异表面抗原的表达免疫荧光检测SSEA胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分离的hES阴性弱阳性强阳性Gearhart分离的hES阳性弱阳性阳性小鼠ES阳性阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。职业教育医学生物技术专业教学资源库（4）胚胎干细胞特异表面抗原的表达RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达

Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子Oct-4，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。职业教育医学生物技术专业教学资源库职业教育医学生物技术专业教学资源库（5）分化能力检测体外分化能力观察:无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：3d“简单类胚体”

5-10d“囊状胚体”

贴壁细胞为细胞分化物。职业教育医学生物技术专业教学资源库体内分化能力观察：ES细胞接种同一品系小鼠腹股沟（107个细胞）或裸鼠、SCID小鼠（106个细胞）→约2周后出现肿块，4-5周进一步增大，摘除肿块→固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构裸鼠和SCID小鼠可接种异种细胞和组织的移植也可接种腹腔，2-3周后观察肿瘤职业教育医学生物技术专业教学资源库嵌合能力测定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化体小鼠（BALB/c小鼠）或纯合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）着床前胚胎内，或将来源于白化体小鼠的ES注射野灰色小鼠或纯合非野灰色小鼠着床前胚胎内，再移植到假孕母鼠子宫内，使之发育成个体。如ES具有嵌合能力，则会融合到宿主胚胎细胞中，并共同发育形成各种组织细胞并产生个体小鼠即为嵌合体，其毛色应是ES细胞来源品系小鼠和胚胎供体小鼠毛色的杂合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。除毛色观察，也可检测同工酶遗传标记，或采用PCR和小卫星DNA方法等鉴定嵌合体。职业教育医学生物技术专业教学资源库四、成体干细胞职业教育医学生物技术专业教学资源库成体干细胞优点获取相对容易源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少成体干细胞还具有多向分化潜能职业教育医学生物技术专业教学资源库但胚胎干细胞也存在自身的优势：胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化的“效率”尚不理想。通过体外的扩增培养能提高转化效率，但是体外的转化是否会引起成体干细胞遗传变化还有待证实，而且这种分化是否是成体干细胞多系分化的结果尚无法肯定。成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。同时开展对两者的研究，能互为裨益，相得益彰。两者的研究对干细胞领域而言都是必要的。职业教育医学生物技术专业教学资源库成体干细胞鉴定方法：科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一致，经常被采用的鉴定方法包括：利用分子标记在活体组织中对细胞进行标记，然后确定它们所产生的特定细胞类型。将细胞从活体动物上分离出来，在对其进行细胞培养的过程中进行标记，之后将细胞移植入另一个动物体内，观察该细胞是否可以再生其来源组织。分离细胞，进行细胞培养，并对其分化进行控制，通常采用加入生长因子或向细胞内引入新基因的方法，进而观察细胞的分化方向。职业教育医学生物技术专业教学资源库

目前研究的成体干细胞（AdultStemCells）骨髓造血干细胞(HSC)外周血干细胞(PBSC)胎肝干细胞脐血干细胞神经干细胞职业教育医学生物技术专业教学资源库造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口1.造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。2.造血干／祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。3.造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。4.造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。职业教育医学生物技术专业教学资源库神经干细胞(nuralstemcell，NSC)

NSC可增殖分化出中枢神经系统的三种基本细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞的生化标记为巢素蛋白及波形蛋白。由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。职业教育医学生物技术专业教学资源库五、研究热点职业教育医学生物技术专业教学资源库五、目前干细胞的研究热点人体干细胞的建株；干细胞保持不分化的培养；干细胞的定向诱导分化；干细胞应用的法律、伦理道德问题；干细胞、组织工程、器官工程；胚胎组织的种植及定向诱导分化。职业教育医学生物技术专业教学资源库六、应用前景职业教育医学生物技术专业教学资源库

六、胚胎干细胞研究的应用前景ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；ES细胞是研究细胞分化的理想手段；ES细胞是研究基因功能的首选细胞；ES细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ES细胞治疗技术将引起一场医学革命；ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。

HumanDiseasemodelHepatocytesBloodCells药物开发、毒性测试临床医疗应用基础医学研究Humandiseasemodel胚胎干細胞的基础医学研发与临床应用职业教育医学生物技术专业教学资源库来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病

细胞类型 治疗的疾病神经细胞

中风、帕金森氏病、老年痴呆症、脊髓损伤、多发性硬化病心肌细胞 心脏病发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞糖尿病软骨细胞 骨性关节炎血细胞

免疫缺乏症、血液病、白血病肝细胞 肝炎、肝硬化皮肤细胞 烧伤骨细胞 骨质疏松症视网(眼)细胞 黄斑症骨骼肌细胞肌肉萎缩症职业教育医学生物技术专业教学资源库干细胞治疗优点明显低毒性（或无毒性），一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。用干细胞治疗疾病已不再只是设想。职业教育医学生物技术专业教学资源库革命性的机制转变利用胚胎干细胞治疗疾病有广泛的应用前景，但是干细胞应用在欧美却受到社会伦理学的制约，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。因此横向分化的发现在干细胞研究中具有革命性意