《分子生物学技术在医学检验中的应用研究8500字（论文）》

STYLEREF标题摘要第2章临床PCR检验2.1标本的类型在临床PCR中，血清（血浆）、血液、外周血单核细胞、痰、棉片、脓液等体液（胸腔积液、腹水、脑脊液、尿液等）、乳液、运输和保存对检测结果有影响。因此，为了验证试验结果的正确性，必须制定收集、运输和保存临床样品的标准程序。2.2标本的采集2.2.1标本采集时间采集过早或过晚都可能会给出假阳性结果，所以一定要把握好最佳时间。2.2.2标本采集部位消毒在开始取样之前，应清洁取样点，以去除受污染的微生物或其他杂质。但是，这必须是适当的，过度净化可能会去除或破坏目标微生物。2.2.3采样量样本的类型和数量应根据已经识别出的引起疾病的微生物来确定，一般要根据引起充足数量疾病的微生物样本来确定，用于提取核酸和测量此后的增长。在病原体含量低的样品中，样品的尺寸是测量的关键。例如，PCR用于血液检查，血液中的特异性抗原或抗体一般含有较少的病原体，因此需要更多的样本。2.2.4样品采集器卫生棉条和其他收集的材料必须是一次性的，运输容器还必须是密封的一次性消毒器。材料中使用的抗凝剂和相关试剂不应妨碍基因的扩大和测试。2.2.5采样过程中的防污染最好使用一次性材料，而不是直接治疗；采集时应特别注意防止污染，混入作业人员皮肤细胞、痰盂等；如果使用玻璃器皿，则必须在0.1%高压水下处理，以使核糖核酸酶能够存活和降解，这可以抑制聚合酶链反应。2.3标本的运送一旦收集了所有的PCR样品，就应暂时储存在2-8℃之下，然后再送往实验室。应尽快将其送到实验室。在无菌条件下收集的DNA靶标样品应在室温下交付实验室8小时；如果核酸是RNA，它可以在室温下运输10分钟。如果需要很长的时间，它应该在冰上运输。2.4标本验收、拒收采集的样本必须从原容器中采集，不能与生化、免疫学等其他样本混用，因为它们之间感染的可能性很高。应拒收溶血或高脂血症等血样。对于沙眼衣原体的扩张，应在显微镜下观察表皮，因为病原体是在上皮细胞中形成的，如果下一层上皮没有或很少，如果在显微镜下观察到的白细胞很少，说明没有收集到合格标本。2.5标本的预处理和保存血清(浆)标本

如果血清样品用于DNA提取和检测，请遵循血清样本的一般处理程序。如果EDTA更适合RNA捕获检测，则严禁使用海洛因。因为它抑制了PCR的增加，在核酸提取过程中很难完全清除，防止凝固后1h内分离血清，4h内分离血浆，放入1.5ml无菌离心管保存。外周血单个核细胞

外周血单个核细胞可以在抗凝剂中产生。主要有两种方法：一种是用淋巴细胞分离液分离产生外周血单个核细胞，另一种是用红细胞溶解液分解全血中的红细胞，用生理盐水反复洗涤可获得单核细胞。痰

痰属于分泌物，临床上经常使用DNA检测结核，痰中含有大量粘稠杂质，DNA提取需要初步处理在室温下用NaOH或变性剂液化约三十分钟，如果液体样品不能立即用于DNA提取，可以保存在-70℃下。棉拭子

在检测性病病原体的PCR程序中，临床样本通常是棉絮，可将棉絮棒置于室温下适量的生理盐水溶液中，完全摇匀洗净，然后在室温下放置5至10分钟。立即离心残余物，随后的沉淀可用于提取DNA。如果不立即使用胶囊提取核酸，则应将其储存于-70℃下。脓液

脓液如用于分枝杆菌测定的标本，黏液可采用痰标本的处理方法来处理，先液化，再离心取沉淀提取DNA;水样的脓液则直接离心沉淀用生理盐水洗2-3次后，即可用于DNA提取。第3章案例分析3.1案例一男性,44岁,腹胀、厌食、乏力间作5年余，加重10余天。饮酒史15年，每天饮白酒约200毫升。患者缘于5年余前无明确诱因出现上腹部胀满不适，食欲不振，周身乏力。到当地卫生院就诊，化验乙肝五项提示“乙肝表面抗原阳性，乙肝e抗原阳性，乙肝核心抗体阳性”，诊断为“慢性乙型病毒性肝炎”，间断服用“护肝片”等药物治疗，病情迁延不愈。近10余天来，患者饮酒后出现上腹部胀满不适症状加重，无腹痛腹泻，无恶心呕吐。食欲不振，周身乏力。在家口服“护肝片、奥美拉唑肠溶胶囊”等药物治疗，症状无减轻，为系统诊治。（一）体查：T36.5℃,P86次/分,R:15次/分,BP130/80/mmhg。神清语利，周身皮肤粘膜无黄染，未见蜘蛛痣及肝脏，未见皮下出血点。口唇无发绀，咽部无充血发红，扁桃体无肿大。颈软无抵抗，甲状腺未触及肿大。胸廓对称，语颤无增强或减弱，叩诊呈清音，双肺呼吸音清，未闻及干湿啰音。心律86次/分，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹平软，右上腹轻压痛，无反跳痛，肝脾脏未触及，肝区叩击痛，移动性浊音阴性，肠鸣音正常存在。双肾区无叩击痛，双下肢无浮肿，四肢肌力、肌张力正常，病理征阴性。（二）辅助检查乙肝表面抗原：500ng/ml。乙肝病毒指数：9.3+7。肝功能：ALT(谷丙)：138.6，AST（谷草）：193U/L，GGT（谷氨酰基转移酶）：867U/L，前白蛋白：41.3mg/dl。尿素氮：2.3mmol/L，肌酐：36.2umol/L，尿酸：440.3umol/L，总胆固醇（TBIL）：6.9mmol/L，高密度脂蛋白：2.91mmol/L，载脂蛋白A：2.60g/L。LDH（乳酸脱氢酶）：248U/L，HBDH（α-羟丁酸脱氢酶）：188U/L。上腹部超声：肝脏实质回声增粗。（三）初步诊断1.慢性乙型病毒性肝炎2.高尿酸血症3.高脂血症（四）诊断依据1.患者上腹部胀满不适，无腹痛腹泻恶心呕吐的症状。食欲不振，周身乏力。2.查体：Bp:130/80mmHg。周身皮肤粘膜无黄染，未见蜘蛛痣和皮下出血点。心肺未见异常。腹平软，右上腹轻压有痛感，无反跳痛，肝脾脏未触及，肝区叩击痛，移动性浊音阴性，肠鸣音正常存在。3.辅助检查资料：化验乙肝表面抗原：500ng/ml。乙肝病毒指数：9.3+.7。肝功能：ALT：138.6，AST：193U/L，GGT：867U/L，前白蛋白：41.3mg/dl。尿素氮：2.3mmol/L，肌酐：36.2umol/L，尿酸：440.3umol/L，总胆固醇：6.9mmol/L，高密度脂蛋白：2.91mmol/L，载脂蛋白A：2.60g/L。LDH：248U/L，HBDH：188U/L。上腹部超声：肝脏实质回声增粗。（五）鉴别诊断1.肝硬化：患者多有慢性肝炎病史，或者长期饮酒、脂肪肝、自身免疫性肝炎，酒精肝等病史，主要表现为右上腹不适症状，周身乏力，可以出现皮肤粘膜黄疸，腹水、上消化道出血等症状，上腹部超声检查可以鉴别。2.慢性胃炎：患者一般表现为上腹部不适，恶心呕吐，可以出现上腹部烧灼感，泛酸，食欲不振等症状。胃镜检查可以鉴别。（六）诊治经过入院后完善各项辅助检查。给予感染性疾病护理常规，II级护理，低盐低脂饮食。予护肝片口服、硫普罗宁、肝水解肽静点以保肝降酶，恩替卡韦分散片口服以抗病毒，辛伐他丁片口服以调脂，维生素C、维生素B6静点以加强营养支持。（七）临床诊断1.慢性乙型病毒性肝炎2.高尿酸血症3.高脂血症（八）分析总结慢性乙型病毒性肝炎是由于HBV感染引起的，如果治疗不及时，可以会发展为肝硬化，甚至肝癌。慢性乙型病毒性肝炎患者需要定期复查肝功能和乙肝病毒指数。如果肝功能在正常范围内，可暂时不用抗病毒药物治疗。如果乙肝病毒指数明显升高，谷丙转氨酶数值在正常数值的2倍以上，无禁忌症，需要常规使用抗病毒药物治疗。目前比较常用的抗病毒药物包括a-2b干扰素、聚乙二醇干扰素、拉米夫定片、恩替卡韦分散片等药物，可以根据患者病情选择，一定要按照疗程用药，避免随意停药，导致病情反弹。要注意定期复查肝功能、乙肝五项、乙肝病毒指数等项目。要注意饮食控制，不要吃辛辣食物，避免饮酒，防止损伤肝细胞。3.2案例二病人男，42岁，发热、食欲减退时达10天。10天前不明原因出现发热，体温在38℃左右,伴有头痛，全身乏力、食欲减退等症,自认为是“感冒”，口服“康秦克”等药物，5天后体温下降至正常，食欲好转，但家人发现患者皮肤发黄因此来医院就诊。（一）体检:T36.5℃，p70次/分，R20次/分，BP110/70mHg巩膜及皮肤黄染,未见肝掌且无出血点，浅表淋巴结无肿大，颈软，心肺正常。腹软，右肋下2.3cm质软有压痛感，表面光滑，脾未及。（二）实验室检查:血常规,血红蛋白126g/L，白细胞5.0×10L，中性粒细胞0.66，淋巴细胞0.34，大便、尿常规正常。（三）肝功检查:ALT450U/L，血清抗HAV-1gM(+)。（四）初步诊断：1.甲型肝炎病毒2.黄疸（五）诊断分析依据HAV主要在肝细胞胞浆内复制，通过胆汁从粪便中排出，HAV只有一个血清型和一个抗原抗体系统，肝炎又分为急性和慢性，急性黄疸型肝炎又分为。黄疸前期，黄疸期，恢复期三个阶段，总病程2～4个月，黄疸前期甲型肝炎于物型肝炎发病较急，常伴全身症状发热，全身乏力，消化道症状，食欲不振，厌油，恶心，呕吐，腹痛，腹泻，尿色逐渐加深。黄疸期自觉症状好转，发热消退，但尿色继续加深，出现黄疸约于二周内达高峰。（六）辅助检查肝功能检查1.血清酶的检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)是反映肝细胞功能的最常用指标;天门冬氨酸氨基酶(AST)存在于线粒体中，意义与ALT相同;碱性磷酸酶(ALP)在肝外梗阻性黄疸、淤胆型肝炎患儿童中可明显升高；γ-谷氨酰转移酶在肝炎活动期时可升高，在肝癌或胆管阻塞、药物性肝炎者中可显著升高。2.胆红素黄疸型肝炎及部分肝硬化患者血清直接和间接胆红素测定均升高，但前者幅度高于血清胆红素是判定肝损伤程度的重要指标之一。急性肝炎早期尿中尿胆原增加，黄疸期尿胆原和红素均增加，梗阻性黄疸时尿胆红素强阳性而尿胆原可阴性。3.血清蛋白慢性肝炎和肝硬化时常有血清清蛋白减少和球蛋白增加。形成A/G值下降，甚置。4.凝血酶原活动度凝血酶原活动度高低与肝损害程度成反比，凝血酶原活动度<40%时提示肝损伤严重。（七）超声检查动态的观察肝脾的形态大小血管分布情况，观察胆囊大小，形态，胆囊壁的厚薄，探测有腹腔积液，有无肝硬化，显示肝门部及后腹部淋巴结是否肿大。（八）肝穿刺活体组织检查肝穿刺活体组织检查能准确判断。慢性肝炎患者所处的病变阶段及预后，同时可进行原位杂交和原位聚合酶链反应（PCR）技术确定病原及病毒复制状态。临床诊断为急性黄疸型甲型病毒型肝炎（九）治疗原则：病毒性肝炎目前还缺乏可靠的特效治疗方法，治疗原则以适当休息合理营养为主，辅以适当的药物治疗，避免饮酒和使用损害肝脏的药物。3.3案例三患者男，68岁，14年前诊断为MPN-PV（骨髓增殖），曾使用羟基脲、别嘌醇及皮下注射干扰素进行治疗。现外周血常规检查：白细胞计数：10.5*109/L升高、血红蛋白测定：64g/L下降、血小板计数：75*109/L，白细胞分类，可见幼粒及幼红细胞；巨脾，甲乙线：10cm，甲丙线：11cm丁戊线1cm；分子生物学检查：jak2/v617f定量82.63%；BCR/ABLP190、BCR/ABLP210定量均为0；JAK2-Exon13、MPL-Exon10、CALR-Exon9均阴性；骨髓活检：骨髓增生极度活跃，粒系，红系，巨系细胞增生伴巨核细胞形态异常及纤维组织增生（MF-2）；骨髓细胞涂片：增生重度减低，成红细胞易见泪滴形红细胞。见图5.1图5.1易见泪滴形红细胞

骨髓涂片

瑞氏染色x1000图5.2泪滴形红细胞易见

偶见原始细胞

骨髓涂片

瑞氏染色x1000图5.3PV后MF诊断标准（WHO，2017）乙型肝炎病毒是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。根据有关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携带者，我国约50%~70%的人群感染过乙肝病毒，其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝癌发病率也在增加。肝癌偏爱的人身上往往有8个特点，分别是：1.得过乙肝2.有肝硬化3.家族中有肝癌患者4.过了40岁更要注意5.嗜酒如命6.喜欢吃霉变食品7.长期患有胆结石8.长期服用某些特定传统药物经过四个案例分析数据得出下图； 图5.4图5.5图5.5图5.6 结论也就是说，分子生物学技术广泛应用于医学、标准化、质量管理等领域。由卫生部开发，对分子生物学的发展起到了重要作用。交叉污染的医疗检查在一定程度上得到了解决。分子生物学的应用主要与完全自动化的医疗系统的发展有关。可有效处理聚氯乙烯污染问题的检查。此外，分子生物学技术。例如，由于自扩增系统等技术的发展，得到了人们的认可。分子生物技术的广泛应用和医学实验室的标准化大大减少了医学检验过程中交叉污染的相关问题，使得医学检验难度大，可以提高整体效率。分子生物学检验技术的临床应用，主要指应用分子生物学检验技术对人类疾病进行诊断和研究的过程。包括病原微生物的诊断、人类基因组相关疾病的诊断恶性肿瘤个体化治疗靶点的选择以及在移植配型和个体识别方面的应用。分子生物学检验技术通过检测病原微生物的特征性基因位点以及患者自身基因结构的变化或表达异常的存在，获得疾病的诊断依据，完成疾病的分子诊断。随着分子生物学检验技术的飞速发展,分子诊断、基因诊断正日渐成为临床上快速、准确的进行疾病诊断的重要途径和手段。参考文献[1]王海英.分子生物学技术在医学检验中的应用进展[J].当代医学,2011,17(06):16.[2]李鹏.现代分子生物学技术在医学检验中的应用[J].临床和实验医学杂志,2007,(03):161.[3]杨振华.为21世纪中国检验医学事业崛起而奋斗——写于本刊更名之际[J].中华检验医学杂志,2000,(01):4.[4]姚均,何忠平,张福杰,等.核酸序列扩增早期诊断人类免疫缺陷病毒感染[J].中华检验医学杂志,2002,(06):42.[5]胡颂恩.分子生物学与检验技术[M].北京:人民卫生出版社,2018.[6]武卫杰,冷远逵,沈梦飞等.基于功能纳米材料的液相生物芯片检测技术[J].化学进展,2019,31(2/3):283-299.[7]徐疏梅.新一代DNA测序技术的应用与研究进展[J].徐州工程学院学报,2018,33(4):60