生物分离知识点

1绪论生物产品要求高质量：纯度、卫生、生物活性方法选择的基本原则1)、尽可能简单、低耗、高效、快速2)、分离步骤尽可能少。3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现4)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。A)、引起新的化学污染；B)蛋白质的变性失活5)合理的分离步骤次序。原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。设计前应了解的信息1）、在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括：(1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等；(2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义；(3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义；(4)、极性大小；(5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等；(6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据；(7)、免疫原性。设计亲和色谱；(8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)；(9)、分子的淌度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等；(10)、等电点pI；2）、成品规格（或产品质量标准）3）、进料的组成和物性(1)、目的产物的浓度。(2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。(3)、目的产物的定位。(4)、菌种的种类和形态。(5)、微生物的含量和发酵液的黏度。4）、生产规模5）、危害性5）、危害性(1)、离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。(2)、目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。(3)、试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)、微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。6）、分批分离还是连续纯化对环境的考虑1）、废水

A、除菌过滤和灭菌处理；B、符合BOD的要求；2）、废料

A、灭菌处理；B、综合利用：动物饲料、饲料添加剂，有机肥料3）、废气

A、除菌过滤和灭菌处理；B、废气（有机溶剂）回收4）、溶剂的回收

A、减少环境排放，减少污染；B、循环利用，减低成本1.4生物分离技术和原理物质分离的本质是识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物性质的差别，利用能识别这些差别的分离介质和扩大这些差别的分离设备实行溶质间的分离或目标组分的纯化。性质不同的溶质在分离操作中具有不同的传质速率和（或）平衡状态，从而实行分离。平衡分离定义：根据溶质在两相间分配平衡的差异实现分离。溶质达到分配平衡的推动力仅取决于系统的热力学性质。溶质达到相间平衡的过程为扩散传质过程，平衡分离又称扩散分离。蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶（沉淀）、泡沫分离、吸附和离子交换等是典型的平衡分离过程。差速分离定义：利用外力驱动溶质迁移产生的速度差进行分离的方法。传统的机械分离方法：过滤、重力沉降、离心沉降典型的差速分离法：超滤、反渗析、电渗析、电泳和磁泳非蛋白类杂质的去除（1）DNAA阴离子交换（pH4.0)B亲和层析（不被吸附）C疏水层析（2）热原（蛋白质溶液中的去热原）A

生产过程无菌

B

所有层析介质无菌C所用溶液无菌

D亲和层析（多粘菌素）（3）去病毒A

加热（60C)B

过滤

C

灭活剂2细胞分离与破碎预处理的目的:改变发酵液的物理性质

(黏度、颗粒大小、颗粒稳定性等)，固液分离速度，分离器分离效率；目标产物转移其中一相(多数为液相)；1、加热最简单、最经济的预处理方法是加热，加热不仅可以增加料液的操作特性，也可以对其进行灭菌。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。加热可产生：¯黏度、促凝聚、¯固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白2、调pH值：方法简单有效、成本低廉pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH可改善其过滤特性。对于氨基酸、蛋白质等两性物质作为杂质存在于液体中时，常采用调pH至等电点使两性物质沉淀。

另外，在膜分离中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，常通过调整pH，改变易吸附分子的电荷性质，以减少吸附造成的堵塞和污染。此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于固液分离。3、凝聚和絮凝通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些杂质。凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚：胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）

机理：a中和粒子表面电荷b消除双电层结构絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程

机理：架桥作用凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中.发酵液的带电现象发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。4、惰性助滤剂：一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。使用方法：A、预涂层；B、按一定比率混合。助滤剂种类：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。用量标准：A、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产量(最常用)；B、或最长周期；C、或最快流速；D、或滤饼的最大空间利用度。5．加入反应剂有时加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、磷酸铝等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。1.无机离子的去除Ca2+离子浓度较高时，可采用可溶性盐，如草酸钠等Mg2+离子的去除一般采用加入三聚磷酸钠磷酸盐处理，也能大大降低Ca2+、Mg2+离子的浓度铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去2．杂蛋白的去除用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。3．多糖的去除酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。4．有色物质的去除发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。

色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。例如活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色，盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色，磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。2.1

细胞分离颗粒的沉降当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：一是微粒受到因微粒和流体介质间密度不同而产生的浮力作用；二是微粒所受到的流体阻力作用。根据沉降作用力可分为：重力沉降、离心沉降根据沉降粒子间相互影响程度可分为：自由沉降和干扰沉降2.1.1重力沉降（1）球形颗粒的自由沉降速度以重力的方向为正方向颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为自由沉降速度自由沉降条件：①颗粒为球形；②颗粒沉降时彼此相距较远，互不干扰；③容器壁对沉降的阻滞作用可以忽略；④颗粒直径不能小到受流体分子运动的影响。在实际情况中还需考虑以下因素的影响：①干扰沉降；

②端效应；

③分子运动；

④非球形；

⑤液滴或气泡的运动。2.1.2

离心沉降P142.1.3过滤概念

过滤是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。过滤介质具有多孔结构，可以截留固体物质，而让液体通过；我们把待过滤的悬浮液成为滤浆，而过滤后分离出的固体称为滤渣或滤饼，通过过滤介质的液体称为滤液（1）过滤介质：过滤介质应具有以下特性：多孔性，足够的机械强度，尽可能小的流动阻力，耐腐蚀性，耐热性，易于再生。工业上常见的过滤介质：织物介质、堆积介质、多孔固体介质、多孔膜。（2）过滤分类：深层过滤、

滤饼过滤（3）过滤推动力：重力（漏斗过滤）、压力（加压过滤）或真空（抽滤）、离心力（离心过滤）。（4）滤饼的可压缩性（5）助滤剂

助滤剂本身就是一性能良好的过滤介质，是一种坚硬、不规则的小颗粒，它能形成结构疏松、空隙率大、不可压缩的滤饼，很大程度改善过滤难度。助滤剂使用方法主要有两种：混合、预涂。2.2

细胞破碎1)、细胞破碎A压撞

B剪切

Ca渗透

Cb冻胀

D破壁破膜2.2.3

细胞破碎技术2.2.3.1机械破碎主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等方法1)、固体剪切法(珠磨法,c最有效的物理破碎法)2)、液体剪切法3)撞击破碎法4)超声破碎法2.2.3.2化学破碎法酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键，使细胞壁破碎。优点：A、产品释放的选择性；B、提取速度和收效高；C、产品的破坏小；D、对外界环境，如pH和温度等要求低；E、不残留细胞碎片。2.2.3.3物理渗透法渗透压冲击法、冻结-融化法机械破碎法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离。

化学破碎法缺点：A、费用高；B、引起新的污染，尤其是其他化学方法；C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。破碎方法的选择选择的一般原则A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法破碎技术杂交研究应注意的问题A、杂交技术可产生很大优势。B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响D、菌种的培育，胞内产物®胞外产物3初级分离3.1沉淀分级沉淀（precipitation)是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、由液相变成固相析出生成固体凝聚物（aggregates)的现象。常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的双重作用。与结晶联系

在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。区别：

结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。优点A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高；B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；C、使中间产物保持在一个中性温和的环境；D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性；E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。缺点：A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；B、过滤较困难蛋白质溶解：相似者相溶aa的亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的比例等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的比例等。如纤维蛋白原。蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。蛋白质是两性高分子电解质（amphotericpolymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。⑴蛋白质周围的水化层（hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。

蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层蛋白质溶液的稳定因素吸引力颗粒间的相互作用，颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。VanderWaals

力Keeson引力（偶极力）Debye

引力（诱导力）London引力（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。DLVO理论

颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。

虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。带电粒子间的静电相互作用取决于ζ电位（绝对值）的大小。粒子表面电位一定，分散层厚度越小，ζ电位越小；分散层厚度为零，则ζ电位为零，粒子处于等电状态，不产生静电作用。

当分散层厚度大，双电层的ζ电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，蛋白质溶液处于稳定状态。当分散层厚度小，ζ电位小，分子间相互吸引作用大于静电排斥作用，蛋白质产生沉淀。3.1.2盐析沉淀影响因素A、无机盐种类结论：a

不同种类的盐主要影响Ks；b

离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。无机盐的挑选原则：a

较高的盐析效能；b

高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c

溶解度受温度的影响小；d

盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；e

不易引起蛋白质的变性；f

价格低廉；最常用(NH4)2SO4优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。B、无机盐添加方式C、温度T

T影响Cohn方程中的b值。T，b¯；T¯，b。D、溶液pH

pH=pI时，蛋白质溶解度最小（b值最小）等电点沉淀法在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。等电点沉淀法中的pH值作用于β值而隐含在Cohn公式中，pI值通常在pH4~6范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。为了提高等电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、有机溶剂法或其他沉淀法一起使用。最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。等电点沉淀法注意事项本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用；在调节等电点时，如果采用盐

酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。3.1.4

有机溶剂沉淀法有机溶剂的种类：

丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。机理：A、增大静电力

有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。

B、去水化层

有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代，从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性。C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。有机溶剂沉淀法的影响因素1、温度2、pH值3、样品浓度4、中性盐浓度5、某些金属离子3.1.4

有机溶剂沉淀法优点：A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；缺点：A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦；B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性；C、收率也比盐析法低；D、试剂易燃，有毒。3.1.5热沉淀利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。3.1.6非离子型聚合物用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。常用非离子性聚合物为Polyethyleneglycol(PEG)：是一种水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用来沉淀蛋白质。优点：1.室温2.颗粒大，易于收集3.提高蛋白质的稳定性4.PEG难去除，幸而PEG通常一般不影响下一步的分离。优点：A、体系的温度只需控制在室温条件下；B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性；D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中。缺点：A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决；B、价格较昂贵。选择性沉淀法概念：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。方法：１）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；２）酸碱变性。３）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。其他沉淀法聚电解质机理：架桥作用、盐析、降低水化度多价金属离子机理：与蛋白质分子上某些残基发生相互作用各种沉淀方法应用范围盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。多与其它方法结合使用。非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀：用于多种物质(特别是小分子)选择性沉淀（热/酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。讨论题：咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油，这是什么缘故？蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白质，蛋白质就是一种高明的乳化剂，它能够把蛋黄中的脂肪分散成很小的油滴，这样就骗过了我们的眼睛和舌头。在盐渍过程中，作为乳化剂的蛋白质被盐析出来，乳浊液被破坏了，那些原来分散成极小的油滴，彼此就互相聚集起来，变成大油液，使得整个蛋黄变成油滋滋的，甚至流出油来了。4膜分离膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。在一种流体相间有一层薄的凝聚相物质，把流体相分隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜。膜本身是均一的一相或由两相以上凝聚物构成的复合体被膜分开的流体相物质是液体或气体膜的厚度应在0.5mm以下，否则不能称其为膜优点:1)、能耗低。膜分离不涉及相变，对能量要求低，与蒸馏、结晶和蒸发相比有较大的差异；2)、分离条件温和，对于热敏感物质的分离很重要；3)、操作方便，结构紧凑、维修成本低、易于自动化。缺点1)、膜面易发生污染，膜分离性能降低，故需采用与工艺相适应的膜面清洗方法；2)、稳定性、耐药性、耐热性、耐溶剂能力有限，故使用范围有限；3)、单独的膜分离技术功能有限，需与气他分离技术连用。以推动力的过程分类以浓度差为推动力的过程：A、透析技术(Dialysis,DS)

以电场力为推动力的过程：A、电透析，B、离子交换电透析

以静压力差为推动力的过程：A、微滤B、超滤，C、反渗透以蒸气压差为推动力的过程：A、膜蒸馏，B、渗透蒸馏4.1.1

反渗透(RO)应用：A、海水淡化，B、超纯水制备，C、抗生素和氨基酸等浓缩，D、回收有机溶剂，如乙醇、丁醇和丙醇等。4.1.2

微滤(MF)应用：A、高分子溶质之间，以及高分子与小分子溶质之间的分离；B、Pro浓缩，C、病毒的分离和富积，D、回收细胞，处理胶体悬浮液。优点：A、消除了滤饼的阻力，过滤效率高；B、超滤回收率高；C、滤液的质量好；D、减少处理步骤4.1.3

透析(DS)原理：浓差扩散用途：

A、人工肾，腹膜透析；

B、样品脱电解质；

C、浓缩富积；

D、气体分离(利用透析袋对不同气体的通透性)优点：

A、方法和设备简单，价格低廉；

B、实验室最常用的样品脱盐方法缺点：

A、透析的速度缓慢；

B、溶质稀释。4.1.4

电透析(ED，IEED)电透析(Electro-dialysis,ED)原理：在透析的基础上加上直流电，极大加快离子的透析速度。

用途：样品快速脱盐。优点：

A、设备简单，B、透析速度极快（提高几十倍），

C、电流直接指示电透析终点，

D、减轻溶质的稀释。终点判断：

A、Cl-

+

Ag+=AgCl¯;

B、电导恒定.4.1.4

离子交换电透析(IEED)机理：透析膜经化学处理后带有正电荷(如季铵基—N+R3)或负电荷基团如(磺酸基—SO2-3)。用途：A、海水淡化，B、苦水淡化C、血浆、IgG、其他蛋白质的分离，D、氨基酸和有机酸分离纯化。优点：可大规模生产

缺点：能耗高4.1.5渗透气化渗透气化：是根据溶质间透过膜的速度不同,使混合物得到分离.渗透蒸发（膜蒸馏）原理

它是利用膜与被分离有机液体混合物中各组分的亲合力不同，而有选择性地优先吸附溶液某一组分，及各组分在膜中扩散速度不同，来达到分离的目的。因此它不存在蒸馏法中的共沸点的限制，可连续分离、浓缩，直至得到纯有机物。

分离过程是用一张渗透蒸发膜,将进料液相和透过气相分隔开,并在气相侧抽真空或通以惰性气流,把渗透组分的蒸气压控制到接近零,液相中产生的化学位梯度（溶质分压差）作为传质推动力的膜分离过程。渗透蒸发膜类型A、优先透水膜材料：主要由亲水材料制成。

如亲水聚合物：含氮原子的壳聚糖衍生物、聚烯丙基胺、交联聚乙烯醇复合物；壳聚糖、纤维素及衍生物、钴交联藻朊酸、磺化聚乙烯离子膜和玻璃纸等。结构特点：这些膜具有很强的脱水能力，主要在于其高聚物结构上存在着大量的亲水基团，如羟基、胺基、铵基阳离子等。这些基团的存在使得膜具有很高的吸附水和扩散水的能力。应用：有机溶液的脱水(有机物为主体，水含量少)。B、优先透有机物膜材料：主要由憎水高聚物制成。

如含憎水的氟原子和硅原子的改性硅橡胶。结构特点：聚合物中含憎水的氟原子和硅原子等。这些结构对有机溶剂的亲和力很大，但对水的无亲和力。应用：主要用于水的纯化、污染控制和有机物的回收等(水为主体，有机物含量少)。有优点，也有缺点A、单级选择性好是渗透蒸发的最大特点。从理论上讲，渗透蒸发的分离度是无限的，适合分离沸点相近的物质，尤其是恒沸物的分离，对于回收含量低的溶剂也是一种好方法。B、过程操作简单，易于掌握，有部分相变，故能耗较低。C、由于操作中进料侧原则上不须加压，所以不会导致膜的压密，渗透率不会随时间的延长而下降；并且在操作过程中形成的膜的溶胀活性层将会自动转化为非对称膜，对膜的透过率和使用寿命有益。D、与反渗透等过程相比，渗透蒸发的通量要小得多，一般在200g/(m2h)以下，而且高选择性的渗透蒸发膜，通量往往在100g/(m2h)左右。E、与反渗透相比，渗透气化过程中溶质发生相变，透过侧溶质以气体状态存在，因此消除了渗透压的作用，从而使渗透气化的操作压较低，适合于高浓度混合物的分离。应用优势：PV在分离有机物是非常有用的，因PV破坏了共沸混合物或挥发度差异小带来的干扰，分离因素取决于膜和化合物的性质。4.2.1

膜材料生物分离过程中，对膜料要有如下要求：A、起过滤作用的有效膜厚度小，超滤和微滤的孔隙率高，过滤阻力小；B、不吸附被分离物质，从而膜不易污染和堵塞；C、使用的pH和温度范围广，耐高温灭菌，耐酸碱清洗，稳定性高D、使用寿命长：经济；D、易通过清洗恢复透过性能；E、适应性广：满足实现分离的各种要求，如对菌体细胞的截留，对生物大分子的通透性或截留作用。

膜材料的种类天然高分子材料种类：纤维素衍生物，如醋酸纤维、硝酸纤维和再生纤维优点：醋酸纤维的阻盐能力最强，常用于反渗透膜，也可作超滤膜和微滤膜；再生纤维素可用于制造透析膜和微滤膜。缺点：醋酸纤维膜最高使用温度和pH范围有限，在45-50°C，pH3-8。膜的水通量定义：

在一定条件下(一般为0.1MPa，温度20°C)，单位时间单位膜面积的水通量(m3m-2h-1)。意义：A、对同类膜，孔径越大，水通量越大；B、水通量并不能完全衡量和预测实际料液的透过流通量。4.4膜操作特征4.4.1

浓度(凝胶)极化模型适应范围：反渗透、超滤和微滤。浓度极化模型：在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高。这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象谓之浓度极化或浓差极化4.4.1

浓度(凝胶)极化模型凝胶极化模型：膜表面附近浓度升高，增大了膜两侧的渗透压差，使有效压差减小，透过通量降低。当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。即使分离含有菌体、细胞和其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。这种现象谓之凝胶极化(gelpolarization)。4.4.2超滤膜的分子截留作用分子截留率(rejectioncoefficient):表征膜对溶质的截留能力。表观截留率：由于膜表面的极化浓度不易测定，通常只能测定料液的体积浓度(bulkconcentration)，因此常用表观截留率，其定义为：真实截留率为：在实际膜分离过程中，由于存在浓度极化现象，真实截留率为:显然，如不存在浓度极化现象，R表观ºR真实。如R表观=1，则cf=0，即溶质完全被截留；如R表观=0，则cf=cb，即溶质可自由透过膜。截留分子的测定：

平板膜的截留率可用搅拌型超滤器间歇测定。操作在较低压力和适当的搅拌速度下进行，避免发生浓度极化。通过测定超滤膜前后的保留液浓度和体积可计算截留率为:其中，c0和c分别为溶质的初始浓度和超滤后的浓度，V0和V分别为料液的初始和超滤后体积。截留曲线:P72意义：A、曲线陡直，孔径分布小，膜有较好的分子量切割作用；B、相反，孔径分布较宽，膜的分子量切割作用较差。截留分子量：通过测定分子量不同的球形蛋白质或水溶性聚合物的截留率，可获得膜的截留率与溶质分子量之间的关系曲线，即截留曲线。一般将在截留率为90%的溶质分子量定义为膜的截留分子量(molecularweightcutoff,MWCO)。膜的评价：当然，MWCO只表征膜特征的一个参数，不能作为唯一指标。膜的优劣应从孔径分布、透过通量、耐污染能力、稳定性、温度、pH、机械强度等多方面考察。截留率的影响因素A、分子特征：分子量相同时，线形分子截留率较低；支链分子较高，球状分子最大。B、电荷：对于荷电膜，膜相同的分子截留率低；反之，截留率较高。C、膜吸附：溶质与膜有相互吸附的，截留率高；相反，截留率较低。D、其他高分子的影响：

当有两种以上的高分子溶质存在时，其中某一溶质的截留率要高于单独存在的情况。这主要是由于：a、竞争性抑制；b、浓度的极化现象使膜表面的浓度高于主体浓度。E、操作条件：温度升高，黏度下降，则截留率降低。膜面流速增大，则浓度极化减低，截留率升高。F、pH值：

当料液的pH值等于蛋白质的pI时，由于蛋白质的净电荷为零，蛋白质间的静电排斥最小，使蛋白质在膜表面形成的凝胶极化层浓度最大，即透过阻力最大。此时，溶质的截留率高于其他pH下的截留率。4.5

膜渗透通量的影响因素操作形式

终端过滤、错流过滤流速：P74意义：k随流速的增大而提高；因此，流速的增大，透过通量增大。适合条件：对蛋白质溶液以及小分子有效，但对细胞和胶体粒子的悬浮液无效。无效性原因：A、错流过滤使凝胶层剥离和流动，从而实际的凝胶层比凝胶极化模型的计算值小；B、菌体物理性质(形状，大小，硬度和填充物等)和生物性质(粘性物质，c膜，壁结构成分，自溶等)不同4.7膜的污染和清洗膜污染---最大问题原因：A、凝胶极化引起的凝胶层，阻力为Rg；B、溶质在膜表面的吸附层，阻力为Ras；C、膜孔堵塞，阻力为Rp；D、膜孔内溶质吸附，阻力为Rap；膜污染不仅造成透过通量大幅度，而且影响产物的回收率。膜清洗A、试剂：水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、络合剂、氧化剂和酶溶液等。B、原则：去污能力好，对膜无损害，成本最低。C、方法：反向清洗，试剂置换，化学降解消化。E、预防：膜的预处理(用乙醇浸泡聚砜膜)，料液预处理(调pH，预过滤)，开发抗污染膜，临界压力操作等。4.8膜技术的应用1)、细胞培养基的除菌；2)、发酵液或培养液中细胞的收集和除去；3)、细胞破碎后碎片的除去；4)、标产物部分纯化后的浓缩或滤除小分子溶质；5)、最终产品的浓缩和洗滤除盐；6)、蛋白质的回收、浓缩和纯化7)、制备用于调制生物产品和清洗产品容器的无热源水；8)、膜生物反应器。1:菌体分离

利用超滤或微滤操作进行菌体的错流过滤分离是膜分离技术的重要应用之一。与传统滤饼过滤和硅藻土过滤相比，错流过滤具有以下1）、优点：

A、透过通量大；

B、滤液澄清，菌体回收率高；

C、不须添加助滤剂或絮凝剂，回收的菌体纯净，有利于进一步分离操作（如菌体的破碎、胞内产物的回收等）。

D、适合于大规模连续操作；

E、易于进行无菌操作，防止杂菌污染。2）、缺点：

膜分离的最大问题是膜污染引起的膜透过通量下降。2：小分子（500-2KD)生物产品的回收3:注射药物的除热源4：蛋白质的回收与脱盐5:膜生物反应器5萃取萃取的优点1

萃取过程具有选择性2

能与其他纯化方法相配合3

通过相转移，减少目标产物的降解4

规模放大极为容易5

传质快、生产周期短6

便于连续操作、易于计算机控制7

无相变、能耗低、成本低8

方法成熟、易于设计5.1.1萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。液液萃取：以液体为萃取剂，当含有目标产物的原料也为液体时，则为液液萃取。液固萃取或浸取：含有目标产物的原料为固体，则为液固萃取。5.1.2

反萃取(Backextraction)：

当萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下步分离操作，往往需要将目标产物转移到水相。这种调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作称为反萃取。洗涤操作(washingprocessing)：对于一个完整的萃取过程，常在萃取和反萃取之间增加洗涤操作

物理萃取：溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。例如，用乙酸丁酯萃取青霉素。

化学萃取：用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化学反应，包括离子交换和络合反应等。如用萃取剂季铵盐(氯化三辛基甲铵，R+Cl-)萃取氨基酸A-。稀释剂(diluent)：化学萃取中通常用煤油、已烷、和苯等溶解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为稀释剂。分配定律：在恒温恒压下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，溶质在两相中的平衡浓度之比为常数A适应条件：相同分子形态（相对分子质量相同）存在于两相中的溶质浓度之比。不适合于化学萃取，因溶质在各相中并非以同一种分子形态存在。分配系数或分配比：是指溶质在两相中的总浓度之比，其用于表示溶质的分配平衡关系A、弱电解质的萃取理论弱碱性电解质的分配系数

B、弱电解物质萃取的影响因素pH的大小；[H]

弱酸性电解质ma

，mb2)

温度是影响溶质分配系数和萃取速度的重要因素。选择适当的操作温度，有利于目标产物的回收和纯化。但由于生物产物在较高温度下不稳定,故萃取操作一般在常温或较低温度下进行。3)

其他因素：无机盐的存在可降低溶质在水溶液中的溶解度，有利于萃取。萃取维生素B12加入硫酸铵；萃取青霉素加入氯化钠等。化学萃取目的由于氨基酸aa和一些极性较大的抗生素的水溶性很强，在有机相中的分配系数很小甚至为零，利用一般的物理萃取效率很低，甚至无法萃取。5.3.3.1水相物理条件的影响①pH值：pH低，有利于酸性物质分配在有机相，有利于碱性物质分配在水相。②温度：一般采用较低的温度。③无机盐：无机盐的存在，有利于溶质转移到有机相。选择原则：根据相似相溶的原理(最重要参数：介电常数，极性)，选择与目标产物性质相近的萃取剂，可以得到较大分配系数。此外，有机溶剂还应满足以下要求：1)、价廉易得；2)、与水相不互溶；3)、与水相有较大的密度差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易；4)、容易回收和再利用；5)、毒性低，腐蚀性小，闪点低，使用安全；6)、不与目标产物发生反应。乳化：水或有机溶剂

以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。常常发生在实际发酵产物的萃取操作中。产生乳化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带：①、发酵液中夹带有机溶剂微滴，使目标产物受到损失；②、有机溶剂中夹带发酵液给后处理操作带来困难。乳化产生原因：是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低。

水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型或W/O乳浊液；

相反，为O/W（oilinwater）水包油型乳浊液。乳化处理1)、在操作前，对发酵液进行过滤或絮凝沉淀处理，可除去大部分蛋白质及固体微粒，防止乳化现象的发生。2)、乳化产生后，采取适当的

破乳手段。A如果乳化现象不严重，可采用过滤或离心沉降的方法。B对于O/W型乳浊液，加入亲油性表面活性剂，可使乳浊液从O/W型转变成W/O型，但由于溶液条件不允许W/O型乳浊液的形成，即乳浊液不能存在，从而达到破坏的目的。C相反，对于W/O型乳浊液，加入亲水性表面活性剂，如SDS可达到破乳的目的。物料衡算:如存在线性平衡,H和L为常数,有萃取因子：萃余率：萃取率：意义：问题:

效率低,为达到一定的萃取率,就需大量萃取剂5.5

双水相萃取双节线(bi-nodal)：

图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS。系线(tieline)：

双节线上两点的直线。系线(tieline)反映的信息A杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则B性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.C

临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。

1)、分配系数m2)、m贡献因子me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献.3)、静电作用非电解质m0：式中,M:溶质分子量;gD:溶质在上下两相表面自由能的差,J/mol。意义：A

不受静电作用的影响(因不带电);B

一般gD>

0，溶质lnm随M而¯；C

ATPS不同,同一溶质的gD也就不同，m随ATPS不同而改变。1)、成相聚合物浓度和M分子量M:若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相.1)、成相聚合物浓度和M存在问题：当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。5.6

液膜萃取由于固体膜存在选择性低和通量小的缺点，人们试图用改变固体高分子膜的状态，使穿过膜的扩散系数增大、膜的厚度减小，从而使透过速度跃增，并再现生物膜的高度选择性迁移。

这是一种以液膜为分离介质、以浓度差为推动力的膜分离操作。它与溶剂萃取虽然机理不同，但都属于液－液系统的传质分离过程。液膜的定义和组成液膜是悬浮在液体中很薄的一层乳液微粒。它能把两个组成不同而又互溶的溶液隔开，并通过渗透现象起到分离作用。乳液微粒组成

1溶剂（水和有机溶剂）：构成膜基体2表面活性剂：乳化作用。它含有亲水基和疏水基，可以促进液膜传质速度并提高其选择性3添加剂：控制膜的稳定性和渗透性将含有被分离组分的料液作连续相，称为外相；接受被分离组分的流体，称内相；处于两者之间的成膜的流体称为膜相，三者组成液膜分离体系。液膜的种类①乳状液膜

②支撑液膜

③流动液膜液膜分离技术的应用液膜分离技术由于其良好的选择性和定向性，分离效率又高，而且能达到浓缩、净化和分离的目的5.7

反胶团萃取5.9超临界流体萃取超临界流体(supercriticalfluid,SCF)对脂肪酸、植物碱、醚类、酮类、甘油脂等具有特殊的溶解作用，因此可用于这类物质的萃取分离。利用超临界流体为萃取剂的萃取操作称为超临界流体萃取(SCFextraction).所谓超临界流体(SCF)即处于临界温度、临界压力以上的流体。在临界温度、压力以上，无论压力多高，流体都不能液化但流体的密度随压力增高而增加。超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。特点：密度接近液体萃取能力强

粘度接近气体传质性能好利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。超临界二氧化碳萃取临界点：Tc=31.26℃、Pc=7.2MPa优点：临界条件温和、产品分离简单、无毒、无害、不燃、无腐蚀性、价格便宜缺点：设备投资大6吸附与离子交换吸附(adsorption)：溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附机制：固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。吸附作用:物质从气体或液体浓缩到固体表面从而实现分离的过程吸附剂:在表面上能发生吸附作用的固体吸附物:被吸附的物质吸附法的特点：常用于从稀溶液中将溶质分离出来，由于受固体吸附剂的限制，处理能力较小；对溶质的作用较小，这一点在蛋白质分离中特别重要；可直接从发酵液中分离所需的产物，成为发酵与分离的耦合过程，从而可消除某些产物对微生物的抑制作用；溶质和吸附剂之间的相互作用及吸附平衡关系通常是非线性关系，故设计比较复杂，实验的工作量较大。6.1.1吸附剂1）、吸附剂分类：A、非多孔类：非多孔性固体的比表面仅取决于颗粒的外表面，比较而言比表面积小，用粉碎的方法可以增加其比表面积。B、多孔类：多孔性颗粒的表面是由“外表面”和“内表面”所组成，内表面积可比外表面积大几百倍。由于颗粒内微孔的存在，比表面很大，可达每克几百平方米，有较高的吸附势。3）、吸附剂的表征A、化学成分B、材料结构C、比表面积D、平均孔径、或平均粒度,及其分布4）、比表面积的测定

一般采用B.E.T(Brunueer-Emmett-Teller)法：在液氮温度下(-196°C)，用吸附剂吸附氮气，在吸附剂表面形成单分子吸附层，测定氮气的吸附体积vm(cm3/g)，计算比表面积a(cm2/g):N-阿弗加德罗常数，s-被吸附分子的横截面积，在-196°C氮气分子的s=1.62´10-15cm2。5）、孔径及分布测定

吸附剂的孔径及分布可采用水银压入法，利用汞孔度计测定。当压力升高时，水银可进入到细孔中，压力p与孔径d的关系为s-水银的表面张力(0.48N/m2)，q-水银与细孔壁的接触角(=140°)。通过测定水银体积与压力之间的关系即可求出孔径的分布情况。6）、吸附力A

范德华力B

静电作用力C

酶与基质结合时的配位键D

疏水相互作用E

空间位阻等F

氢键7）、吸附类型A

物理吸附

吸附剂和吸附物通过分子间力(范德华力)产生的吸附称为物理吸附。这是一种最常见的吸附现象，其特点是吸附不仅限于一些活性中心，而是整个自由界面。B、化学吸附

化学吸取附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力范围，它与通常的化学反应不同的地方在于吸附剂表面的反应原子保留了它或它们原来的格子不变。C

物理吸附与化学吸附的比较D

交换吸附

交换吸附类型:1st

极性吸附:吸附剂表面如为极性分子所组成，则会吸引溶液中逞相反极性的物质或离子而形成双电层，这种吸附称为极性吸附。2nd

离子交换:在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等当量的离子于溶液中。交换吸附的决定因素:1st离子所带电荷越多，它在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力就越强2nd电荷相同的离子，其水化半径越小，越易被吸附。6.1.2

离子交换剂1）、离子交换剂A

cationexhanger-Na+:

包含强酸性和弱酸性阳离子交换剂B

anionexchanger+F-:

包含强碱性和弱碱性阴离子交换剂。C

交换剂的种类

小分子类交换剂：苯乙烯-二乙烯苯型、丙烯酸-二乙烯苯型、酚醛型2）、性能评价A

交换容量(exchangecapacity)指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数(mmol)，是表征交换剂离子交换能力的主要参数。B

交换容量的测定

对于阳离子交换剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应1st树脂孔道的空间排阻作用大；2nd交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；3rd蛋白质的多电荷与多个交换中心结合C

滴定曲线

全面评价表征交换剂的重要参数方法：1g氢型(或羟型)交换剂+x-ml0.1MNaOH/orHCl+水至50ml(其中1支+50ml0.1MNaCl)+静置24h(对强交换剂)/or7d(对弱交换剂)+测pH+作图意义：1st强离子交换剂的交换；2nd弱离子交换剂的交换；3rd滴定曲线的转折点

交换容量；4th转折点数

交换基团的种类数；5th交换容量随pH的变化。6.4

固定床吸附操作1)、单柱吸附饱和(最大)吸附浓度q0:与入口料液浓度c0相平衡的吸附浓度。穿透曲线(breakthroughcurve)：吸附过程中吸附柱出口溶质浓度的变化曲线。穿透时间:一般为出口浓度达到入口浓度的5%-10%的时间。穿透点(breakthroughpoint):出口处溶质浓度开始上升的点洗脱(elution)：再生(re-generation)：浓度波/吸附带/交换带：吸附塔中液相或固相溶质浓度从c0/或q0到0的分布区带。传质区：在交换带中发生的液、固相之间的传质恒定图式分布(constantpatern)：浓度波以恒定的形式移动，一般发生在Langmuir和Freundlich型的吸附操作中。2)、多柱串联吸附3)、动态法测定吸附量

曲线1为不吸附溶质的穿透曲线，对应的体积为V0。曲线2为吸附溶质的曲线，对应体积为V。吸附剂吸附溶质的量为斜线面积，即为c0(V-V0)。利用不同浓度的溶液反复作吸附操作，即可得到吸附平衡关系q*=f(c).固定床：

在吸附颗粒确定以后，床层的膨胀与通过床层液体的表观流速U有关。当U不大时，颗粒之间仍保持静止并互相接解，这为固定床。流化床：

当U增大至起始流态化速度Umf，颗粒不再相互支撑，开始悬浮在液体中；进一步提高U，床层随之膨胀，床层的压力降几乎不变，但床层中颗粒的运动加剧，这时的床层为流化床。优点：A

压降小，可处理高黏度或固体颗粒的粗料液；B

不需要特殊吸附剂，设备操作简单。固定床优点：流体在介质层中基本上呈平推流，返混小，柱效率高。缺点：无法处理含颗粒的料液，因会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行。流化床缺点：存在严重的返混，特别是高径比很小的流化床，使床层理论塔板数降低，吸附剂的利用率低。1)、膨胀床

综合固定床和流化床的优点，使吸附颗粒按自身的物理性质相对稳定地处在床层中的一定层次上实现稳定分级，而流体保持以平推流的形式流过床层，同时吸附颗粒间有较大的空隙，使料液中的固体颗粒能顺利通过床层7液相色谱1)、按应用的目的A、制备性色谱：工业规模，实验室规模B、分析性色谱：GC、LC、HPLC、TLC等。2)、按流动相A、GC:

气-固色谱法(固定相为固体)

气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相)B、LC

液-固色谱(固定相为固体)

液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上)3)、按色谱的展开形式A、柱色谱法B、毛细管色谱法C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱纸层析是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹。展开剂的选择

展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂。常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展开方式3种：上行色谱

、下行色谱、径向色谱纸层析和薄层层析分离过程纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。薄层色谱法：将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法常用的固定相有：硅胶和氧化铝优点：设备简单、操作方便、快速、显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色、灵敏度高（较纸层析）、可以大量制备1.层析纸和层析板

特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。2.展开剂由一种或多种溶剂按一定比例组成。

如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。3.点样用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。4.显色、检测有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。特点及应用：平板色谱简单、方便、及操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。

采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。

试样一般不需要经过预处理即可分离。柱色谱洗脱方法洗脱一般有三种方法：①恒定洗脱法

②逐次洗脱法

③梯度洗脱法，梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。7.1.2

色谱分类按展开程序A)、洗脱法B)、顶替法C)、迎头法洗脱法又称淋洗法，如将含三组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱。前沿法(frontalmethod)又称迎头法，如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个和第一个组分混合流出。置换法(displacementmethod)又称顶替法，当含三种组分的混合物样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将他们洗脱下来，为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相，当它注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。7.1.3

色谱的名词术语分配系数m：m=cs/cm式中，cs和cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。分配系数m类型：A、B型曲线是一条典型的吸附等温线，吸附色谱法属于这类曲线。C和D型吸附等温线很少遇到C曲线为线性分配等温线。线性色谱：溶质浓度低时，m为常数时的色谱意义：溶质流过色谱柱时，m大的组份通过色谱柱所需要的时间长，m小的组份需要的时间短；当样品中各组份在两相的m不同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。A、基线：B、峰高：色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。C、保留值：死时间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近：保留时间tr：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。调整保留时间tr’：保留时间tr的表达：时间单位(如s,d,h),距离单位(如cm)，体积(ml,l)表示。tr意义：色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。D、死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时，VM可由tm与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算：E、保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如右图：F、调整保留体积V’R：某组份VR扣除VM后，称该组份的V’R，即G、相对保留值g2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比，即：由于g2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。注意：g2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标值(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时gr,i可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号a表示：式中t’r,2为下一峰的调整保留时间，所以这时a总是大于1。H)、分配比k,

即容量因子：意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数k与m的关系：4)、区域宽度色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：A、标准差s：0.607倍峰高处峰宽的一半。B、半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与s的关系为C、基线宽度Y：色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。它与s的关系是色谱曲线反映出的重要信息：A、根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少数；B、根据色谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析；C、根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析；D、依据色谱峰的保留值及其区域宽度，评价色谱柱分离效能；E、色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。两组份完全分离必须满足：A、两组份的分配系数必须有差异；B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。它不仅应说明组份在色谱柱中移动的速率，而且应说明组份在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。速率理论对色谱分离条件的选择具有实际指导意义。7.2.2理论板模型塔板模型:将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板高(platehigh)为H。假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n称为理论塔板数(theoreticalplatenumber)。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H的增大而减小。理论塔板数n与半峰宽及峰底的关系式为:式中

tr(或Y1/2)

应采取同一单位(时间或距离)。上式示：在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。常用有效塔板数n有效表示柱效：

例1已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的理论塔板数。例2已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块，组份A在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔板高度7.3分离度柱效n：衡量柱效的指标是n(或neff)，柱效则反映了色谱分离过程的动力学性质。选择性a：

为洗脱峰相临的两种溶质的容量因子之比.分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比，即当Rs<

1时，两峰总有部分重叠；当Rs=1时，两峰能明显分离；Rs>1.5时，两峰才能完全分离。当然，更大的Rs值，分度效果会更好，但会延长分析时间。利用上式，可以直接从色谱图上计算分离度。但该式没有体现影响分离度的诸因素。而下式清楚地指出了，分离度受柱效n、选择性a和容量因子k三个参数的控制：意义：第一，增加塔板数，可以增加分离度，若通过增加柱长来增加塔板数，就会延长分析时间。所以，设法降低塔板高H，才是增大分离度的最好方法。第二，加大容量因子可以增加分离度，但是会延长分析时间，至造成谱带检测困难。一般来说，当k>

10时，分离度的提高并不明显；而当k<

2时，洗脱时间会出现极小值。因此，在色谱分离中，通常将k控制在2--7之间。第三，选择性参数a的微小增大，都会使分离度得到较大的改善。当a>

2时，即使在很短的时间内，组份也会完全分离。当a»1时，要完成分离，必须增加柱长，延长分析时间。例如，为了达到同样的分离度，当a=1.01时，所需的时间是a=1.1时的84倍。显然，当a=1时，无论怎样提高柱效，加大容量因子等，Rs均为零。在这种情况下，两组份的分离是不可能的。定性分析1st在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留时间。2nd

相对保留值g2,1：定量分析定量依据

在一定色谱条件下，组份i的质量(mi)或其在流动相中的浓度，与检测器响应讯号（峰面积Ai或峰高hi）成正比：

式中fiA和fih是绝对校正因子。定量校正因子1st绝对校正因子

组份峰面积和峰高的绝对校正因子分别为：由此可见，绝对校正因子是指某组份通过检测器的量与检测器对该组份的响应信号之比。存在问题：

很明显，绝对校正因子受仪器及操作条件的影响很大，偶然误差和系统误差较多，故其应用受到限制。2nd相对校正因子：指组份i与基准组份s的绝对校正因子之比，即式中fAis和fhis分别为组份的峰面积和峰高相对校正因子，fAs和fhs分别为基准组份s的峰面积和峰高绝对校正因子。必须注意，相对校正因子同量纲(相当于同身寸尺)。绝对校正因子很少使用，一般文献上提到的是相对校正因子。

优点：相对校正因子消除了偶然误差和系统误差较.3rd相对响应值：也叫相对应答值，即相对灵敏度，当计量单位相同时，它们与相对校正因子互为倒数：定量方法外标法(亦称标准曲线法)1st作标准曲线：

该法是在一定色谱操作条件下，用纯物质配制一系列不同的浓度的标准样，定量进样，按测得的峰面积对标准系列的浓度作图绘制标准曲线。2nd定量分析进行试样分析时，在与标准系列严格相同的条件下定量进样，由所得峰面积从标准曲线上即可查得待测组分的含量。3rd优点：外标法的优点是操作和计算简便，不需要知道所有组分的相对校正因子，其准确度主要取决于进样量的准确和重现性，以及操作条件的稳定性。4th存在问题：

结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。内标法

当试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个或几个组分时，可用此法。准确称取m(g)试样，加入某种纯物质ms(g)作为内标物，根据试样和内标物的质量比ms/m及相应的色谱峰面积之比，基于下式可求组分i的百分含量Wi%：1st

内标物的选择条件是：内标物与试样互溶且是试样中不存在的纯物质；内标物的色谱峰既处于待测组分峰附近，彼此又能很好地分开且不受其它峰干扰；加入量宜与待测组分量相近。

内标法的优点是定量准确，操作条件不必严格控制，且不象归一化法那样在使用上有所限制。缺点是必须对试样和内标物准确称重，比较费时。2nd优点

内标法是通过测量内标物及欲测组份的峰面积的相对值来进行计算的，因而可以在一定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差。3rd内标法的缺点：

在试样中增加了一个内标物，这常常给分离造成一定的困难。4th内标法的条件

A、内标物必须是待测试样中不存在的；

B、内标峰应与试样中各组份的峰分开，并尽量接近欲分析的组份。归一化法如果试样中所有组分均能流出色谱柱并显示色谱峰，则可用此法计算组分含量。设试样中共有n个组分，各组分的量分别为m1，m2，……，mn，则i种组分的百分含量为：优点是：简便、准确，进样量的多少不影响定量的准确性，操作条件的变动对结果的影响也较小，对组分的同时测定尤其显得方便。缺点是：

试样中所用的组分必须全部出峰，某些不需定量的组分也需测出其校正因子和峰面积，因此应用受到一些限制。7.4凝胶过滤色谱7.4.1原理与操作定义：凝胶过滤

即凝胶过滤层析，也称分子排阻层析、尺寸排阻、分子筛层析

是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。图示（262），在装填具有一定孔径分布的凝胶过滤介质的层析柱中，料液中溶质1的相对分子质量很大，不能进入到凝胶的细孔中，因而从凝胶间的床层空隙流过，洗脱体积为层析柱的空隙体积；

对子溶质4，其相对分子质量很小，能够进入到凝胶的所有细孔中，因而其洗脱体积接近柱体积；相对分子质量介于溶质1和溶质4之间的溶质2和3可进入到凝胶的部分细孔中，故其洗脱体积介于空隙体积和柱体积之间，根据相对分子质量的差别（溶质2的相对分子质量大于溶质3）顺序洗脱。相对分子质量大于溶质l和小于溶质4的溶质的洗脱体积分别与溶质1和溶质4相同。GFC操作中溶质的分配系数M只是相对分子质量、分子形状、凝胶结构(孔径分布)的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下、相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocraticelution)。GFC可分离系统体积介于V0和Vt之间的溶质，分离精度有限，料液处理量也很小，只有当料液体积小于两溶质的洗脱体积差，才有可能完全分离。凝胶层析的操作

（1）凝胶的处理

葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中，慢慢搅拌。洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。这是因为大多数凝胶都含有少量羧基，如果洗脱剂的离子强度低于0.08，少量羧基不能被屏蔽，凝胶颗粒就具有离子交换性质，从而改变溶质的分配系数。溶胀时不能用电磁搅拌器，这样会使颗粒损坏，产生大量粉末，影响流速。溶胀要完全，否则影响层析的均一性，甚至有使柱破裂的危险，加热可使溶胀加速。溶胀时搅拌可能产生很细的颗粒，必须将其除去，否则会严重降低柱的流速琼脂糖凝胶是以浓的悬浮液的形式出售的，不需溶胀。（2）装柱

装柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、玻璃细孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。凝胶要悬浮在洗脱剂中，在搅拌下缓慢加入柱中，使凝胶自然沉积，直到所需高度为止。

床层要均匀，不能有纹路或气泡。装柱时要考虑凝胶的承压能力，如压力太高，凝胶会被挤压变形而影响流速。（3）上样和洗脱

柱床经洗脱剂平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱剂，再用滴管轻轻沿柱壁将试样加入至柱的上面，防止扰动填充层表面，打开柱底部的流出口，使样品液渗入凝胶床内。

当样品液面恰与凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。这一步关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶表面干燥而发生裂缝。然后用大量洗脱剂洗脱，并收集相应的洗脱液。

非水溶性物质的洗脱采用有机溶剂（如苯和丙酮），水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。pH的影响与被分离物质的酸碱性有关，在酸性pH时碱性物质易于洗脱，在碱性pH时酸性物质易于洗脱。多糖类物质的洗脱以水为最佳，有时为了使样品溶液解度增加而使用含盐洗脱剂。4）凝胶的再生和保养

理论上因为凝胶本身不与溶质发生作用，所以层析分离后无需再生处理，但实际操作时凝胶层常有一定的污染，必须作适当的处理。

交联葡萄糖凝胶柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液处理。聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶由于遇酸、碱不稳定，常用0.5mol/LNaCl处理。为了抑制微生物在凝胶层内生长，在凝胶床保存之前必须完全除去磷酸根离子和所有底物，将柱真空保存或低温保存，但温度不可过低，离子强度要高一些，以防冻结。经常使用的凝胶以湿态保存为主，只要在其中加入适当的抑菌剂就可放置几个月至一年，不需要干燥。7.4.2凝胶过滤介质

凝胶过滤层析常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。因此，良好凝胶过滤介质应满足以下要求：①亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；②稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；③

具有一定的孔径分布范围；④

机械强度高，允许较高的操作压力(流速)。Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度较低。7.4.2.2表征凝胶特性的参数排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。分级范围：凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量。凝胶粒