T-LTIA 26-2024 基于SeqFD技术的物种鉴定技术规范

基于SeqFD技术的物种鉴定技术规范2024-09-12发布2024-10-01实施I Ⅱ 1范围 1 13术语和定义 14缩略语 15技术原理 16试剂或材料 26.1DNA提取试剂盒 26.2采样 26.3PCR试剂 2 27仪器设备 2 38.1操作要求 38.2实验条件 3 3 38.5SeqFD测序文库构建 3 3 3 4 4 49结果分析 49.1结果计算 49.2结果判定 4附录A(规范性)DNA提取和文库构建实验步骤 5A.1实验步骤 5附录B(资料性)引物序列 6附录C(资料性)PCR扩增体系 8附录D(资料性)PCR扩增程序 9 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件由深圳市生命科技产学研资联盟提出并归口。本文件起草单位：海南大学三亚南繁研究院、深圳华大生命科学研究院、深圳华大智造科技股份有限公司、海南省种业实验室、海南大学三亚研究院、武汉华大生命科学研究、三亚海古纪生物科技有限公司、深圳市生命科技产学研资联盟。本文件主要起草人：夏志强、李小强、周红梅、李启沅、吴静静、华聪、邹枚伶、魏晓锋、游丽金王伟文、李涛、余乐俊、夏勉、黄河飞、孙建波、何沛欣、王博、王逸丛、谢伟、武庆超、骆顺、李陶本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到条款8.4和条款8.5中SeqFD技术和文库构建相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利特有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联专利持有人姓名：夏志强、邹枚伶、王文泉。地址：海南省三亚市崖州区海南大学三亚南繁研究院。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责1基于SeqFD技术的物种鉴定技术规范本文件规定了基于SeqFD测序技术物种鉴定的原理、试剂或材料、仪器设备、实验步骤、结果分析.本文件适用于与农业相关的植物和动物样本，如水稻、木薯、甘蔗、马铃薯、猪和牛等物种鉴定。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则GB/T38551植物品种鉴定MNP标记法GB/T38570植物转基因成分测定目标序列测序法GB/T42751—2023信息技术生物特征识别高通量测序基因分型系统规范GB/T42751—2023界定的以及下列术语和定义适用于本文件。能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产生不低于100M碱基对的测序数据。指在DNA序列中，某一位置上可以是多种可能的碱基之一，用于设计能够结合多个相似序列的引物。这种设计增加了引物的通用性，使其能够识别含有序列变异的多个目标。SeqFD是一种极致简化、全基因组覆盖、高通量的DNA测序文库制备和基因分型方法。下列缩略语适用于本文件.BLAST:局部相似性基本查询工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyriboNucleicAcid)NCBI:美国国立生物技术信息中心(NationalCenterForBiotechnologyInformation)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)设计含有简并碱基的引物，构建样本基因组测序文库，利用多重聚合酶链式反应(PCR)进行文库扩增和高通量测序，分析测序数据，获得比对结果和鉴定结论。2通过使用含有简并碱基的引物，构建样本基因组测序文库，进行高通量测序。引物的核心部分由4个稳定不变的碱基构成。另外，为了增加引物的灵活性和适应性，设计中还包括了3个可变化的碱基 (NWNNYN的组合),形成了所谓的弹性序列。这种设计使得引物能够适应并结合到基因组中的多种不同序列，从而增加了测序的广度和深度。这些碱基构成的引物能够结合基因组的内含子、编码序列、NT数据库中的序列进行快速比对，找出潜在的匹配区域，然后计算这些区域的相似性得分，返回评分最高的匹配序列。统计匹配序列归属的物种，并通过本文件的6试剂或材料6.2采样6.3PCR试剂6.4引物6.4.2引物和样本对应关系宜根据样本数量和实验批次数选择。若只进行1批测序，则物种来源不同的待测样本份数不得大于96份，每份样本对应不同的引物编号；若选择多批测序，则物种来源不同的本进行至少3次技术重复。——高通量测序仪(测序300nt~700nt长度片段);——离心机(TGL-20M,转速2000r/min);38.1.1样品准备、DNA提取、PCR扩增应按照条款6.1、6.2和6.3要求准备材料且规范化仪器操作。8.2.2实验过程中应戴好口罩、穿戴实验服、橡胶手套，谨防吸入口鼻同时也避免外源DNA的污染。8.3.2样本宜为植物较为幼嫩且新鲜的叶、根、茎等器官或组织，可为果实或种子；或是新鲜的动物文库构建主要包括DNA浓度均一化、96孔板加样、离心、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等5个步骤测序数据分析环境的搭建主要分为两部分：在NCBI下载BLAST工具和安装，下载NT库后使用注1:NCBI网址为/blast/db/.注2:BLAST工具下载的网站为https//blast,版本号：2.13.0.注3:NT库下载地址为/blast/db/FASTAnt.gz注：fastp软件版本号为0.20.应根据要求进行测序数据质量控制，要求具体见表1.类别30%～50%之间重复率°4表1测序数据质量要求(续)类别Q30值是指测序数据中碱基错误率在千分之一以下的比GC含量是指测序数据中G和C碱基的比例。重复率是是指测序数据中重复的碱基对的比例。8.9BLAST比对5DNA提取和文库构建实验步骤A.1实验步骤A.1.1.2实验过程中使用到的PCR板等仪器应灭菌后再使用。A.1.2实验条件A.1.2.1实验室保持干净整洁，避免污染A.1.2.2实验过程中戴好口罩、穿戴实验服、橡胶手套，谨防吸入口鼻同时也避免外源DNA的污染。A.1.3取样A.1.3.2取材后立即液氮速冻，保存于液氮或超低温冰箱中。A.1.3.3若为-80℃冰箱保存的样品，研磨前应避免样品化冻变软，研磨过程中也保持低温。A.1.4DNA提取DNA提取主要包括细胞裂解、细胞沉淀、洗涤、纯水/TE溶液纯化收集等4个步骤。DNA提取应a)将纯化收集后的样品DNA进行浓度均一化，浓度建议控制在100ng/μL左右；b)将DNA、引物(引物序列见附录B)、混合液加入96孔板中(扩增体系见附录C),实验操作过程需全程在低温环境(0℃~20℃)下进行；c)加样结束后对96孔板放进行离心，将离心后的样品放入PCR仪中进行扩增(扩增程序见附录d)对扩增后的PCR产物进行凝胶电泳检测，电压50V,时间设置40min;将300bp~700bp的时间保存应在-20℃保存。6(资料性)引物序列引物序列见表B.1。表B.1引物序列序号引物(从5′端到3′端；Forward-Reverse)1TAGCTCGACACTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG2TAGCTCTGGAATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG3TAGCTCGAACAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG4TAGCTCGGCATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG5TAGCTCCCGCTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG6TAGCTCGACATACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG7TAGCTCCGACAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG8TAGCTCTGGTGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG9TAGCTCTTAGCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGTGCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAAGACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCTTCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCGAAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGGTAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTCGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTTAACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCCACACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTTTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTCCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACTTCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCGTTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGATTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCAATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGCGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGATTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTCCATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCAGCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAACCGCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGATCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCCCAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTGAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCGGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTCTAACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAATCTGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTACGTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGAACTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCACTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAAGTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGATGACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG7表B.1引物序列(续)序号引物(从5'端到3′端；Forward-Reverse)TAGCTCTCGTTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAACCTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACAATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTACAGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGCTTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCATACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTGACGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCACCTGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTGCCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATTACGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAGTGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAACGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTATCGACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTGCTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGGTATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGAGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTACAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCTTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCATCCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTACCGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCATTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACTCCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCCGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCCTCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCTACCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACACCTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTCAACCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGATCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGTAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCAGTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCTAGATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGAACTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGCTGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGAATGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGCAGGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTGGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGTCATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCCGCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATCATCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGGGTCACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCACCTTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAAACGCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAAGGGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTTTCGTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCAGTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCATATCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCGTCTCCCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTCACATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCCCGTATCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCTAGGTACAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACGTAGCTCAGACTTCAAACCGGNWN-GTCAGACTGCGTACG8(资料性)参加PCR反应的物质脱氧核苷三磷酸(dNTP)引物条形码(0.01mol/L)9PCR扩增程序表D.1PCR扩增程序时间15延伸延伸延伸1/[1]Margulies,M,Egholm,M,Altman,W.etal.Genopicolitrereactors.Nature