T-LNEMA 019-2024 水体中抗生素原位采样分析技术规程-薄膜扩散梯度（DGT）法

水体中抗生素原位采样分析技术规程—薄膜扩散梯度（DGT）法TechnicalRegulationsforInSituS—DiffusiveGradientsinThinFilms(DIT/LNEMA019—2024前言 II 12规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理 5材料及试剂 6仪器和设备 48水体中抗生素的测定步骤 9结果计算 10精密度和准确度 8T/LNEMA019—2024本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由辽宁省大连水文局提出。本标准由辽宁省环境监测协会归口。本标准起草单位：辽宁省大连水文局、大连理工大学、大连市生态环境事务服务中心、大连计量检验检测研究院有限公司、辽宁省生态环境事务服务中心、辽宁省水资源管理和生态环保产业集团、辽宁省生态环境厅、辽宁省生态环境保护科技中心、辽宁省生态环境监测中心、辽宁省抚顺水文局、辽宁省辽阳生态环境监测中心、苏州科技大学等。本标准主要起草人：孙大明、谭峰、赵辉、王主华、王丹阳、马芮、王阳、李崇、刘首正、原晖、邸俊强、夏春龙、唐贺、赵璐璐、白玉花、汪琛棋、屈兴胜、柴浩、徐明晗、郭一冰、赵云、董淑玲、杨瑞丰、武暕、张子伯、赵德君。1T/LNEMA019—2024水体中抗生素原位采样分析技术规程—薄膜扩散梯度（DGT）法本标准规定了水体中抗生素含量的薄膜梯度扩散（DGT）法测定流程。本标准适用于地表水、地下水、海水、工业废水和生活污水中的氟喹诺酮类、磺胺增效剂甲氧苄基嘧啶以及磺胺类抗生素的原位采样分析。2规范性引用文件本标准引用下列文件或其中的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。HJ495-2009水质采样方案设计技术规定HJ494-2009水质采样技术指导GB/T14581-1993水质湖泊和水库采样技术指导GB3838-2002地表水环境质量标准GB5084-2021农田灌溉水质标准GB8978-1996污水综合排放标准GB5749-2022生活饮用水卫生标准、GB3097-1997海水水质标准HY/T147.1-2013海洋监测技术规程第1部分：海水DB22/T2838-2017生活饮用水及水源水中10中抗生素的检验方法超高效液相色谱-质谱/质谱法DB21/T3286-2020水质5种磺胺类抗生素的测定固相萃取高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法DB32/T3771-2020渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定液相色谱-串联质谱法DB37/T3738-2019水质磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定固相萃取/液相色谱-三重四极杆质谱法DB65/T3951-2016水质多种药物残留量的测定液相色谱串联谱法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抗生素antibiotics本标准中的抗生素主要指氟喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素以及磺胺增效剂甲氧苄基嘧啶等有机污染物。3.2原位测定insitumeasurement指在不扰动样本原有状态的前提下，获得关于其化学、物理、生物性质的数据，保证待测物质的形态和浓度不发生变化。3.3薄膜扩散梯度diffusivegradientinthinfilms一种新型被动采样技术，标准的DGT装置由结合相，扩散相，滤膜以及固定这三层膜结构的塑料外套组成。利用具有一定厚度的扩散相凝胶将能够与目标物发生不可逆结合的结合相和待测环境隔开，2T/LNEMA019—2024待测物扩散通过扩散相凝胶后被结合相吸附。在材料的有效吸附容量内，目标物的富集量与富集时间有关，从而可以通过测定结合相上目标物的质量确定外界环境中待测目标物的浓度。3.4DGT结合相DGTbindinggelDGT结合相是指DGT方法中用于吸附待测物的薄膜，组装到DGT结构的最内层，常用的结合相材料为聚合物树脂、商业SPE柱填料和新型吸附材料。3.5DGT扩散相DGTdiffusivegelDGT的扩散相是指为待测分子提供扩散通道的薄膜，组装在DGT结构的中间层，是定量计算的基础。常用的扩散相材料有包括琼脂糖交联聚丙烯酰胺凝胶(APA)和琼脂糖凝胶。3.6DGT滤膜filtermembraneDGT装置的滤膜一般指内部孔径为0.45μm的滤膜，常用的DGT滤膜有聚偏氟乙烯膜(PVDF)、硝酸纤维素膜(CN)、醋酸纤维素膜和亲水性聚醚砜滤膜(PES)。3.7扩散系数diffusivecoefficient扩散系数是指目标离子在单位时间每单位浓度梯度的条件下、以扩散的方式垂向通过单位面积扩散相的质量或摩尔数。它是一个衡量某种物质分子通过随机运动在另一种物质中传播速度的指标。4方法原理DGT技术是以Fick第一扩散定律为理论基础，整个装置由结合相、扩散相和滤膜以及固定这三层膜的上下两部分的塑料外套（AES树脂）组成（图1）。塑料盖子可以卡在底座上，使底座、吸附膜、扩散膜、滤膜无缝接触，盖子上有直径为2cm的窗口，待测物质通过窗口扩散进入内部凝胶。图1DGT装置以及采样原理图其中，滤膜主要用来避免外界颗粒物进入装置内部，扩散相提供待测分子的扩散通道，而结合相对待测物质具有吸附作用，可以根据不同的分析物选择不同的结合相材料。外部分析物通过滤膜以及扩散相，最终固定在结合相上。通过测量结合相上吸附目标物的质量（M）可以实现对外界环境浓度（Cb）的定量。由于扩散相的存在，使得在装置表面扩散紊流层占总体扩散通路比率大大减小，在流动良好的水体，紊流层厚度(δ)可以忽略不计。在静态水中，也可以使用不同厚度的扩散相装置进行准确定量紊流层厚度。另外，参数扩散系数是每个目标物特有的参数，可以在实验室条件下单独测定得到，此参数受实际环境条件影响很小，可以直接应用于实际采样过程中的计算，无需额外校正，相较于其他被动采样器，定量准确性大大提高。3T/LNEMA019—2024此外，在DGT实际采样过程中，复杂、多变的环境介质往往会对结合相表面电荷状况、目标物的状态等造成影响，但实验表明当pH在4~9的变化范围内、离子强度0.001~0.75mol/L的范围内、溶解性有机质（DOM）介于0~20mg/L的范围内时，DGT装置的采样性能几乎不受外界环境干扰。而在自然环境中，不同水体的pH、离子强度和溶解性有机质（DOM）浓度普遍在5~8.5，0.01-0.5mol/L和1~20mg/L范围内，因此，实际采样时复杂的外界环境条件DGT采样的效果没有明显的影响。5材料及试剂所使用的试剂除了另有说明外，均为符合国家标准的分析纯，实验用水为新鲜制备的去离子水或蒸馏水。5.1材料DGT装置、氮气、DGT有机玻璃投放器、浮标、手持式GPS仪、温度计、塑封袋、10mL离心管等。5.2试剂5.2.1纯水实验室用水应为一级水、应符合GB/T6682相关要求。5.2.2乙腈（CH3CN）液相色谱纯。5.2.3甲醇（CH3OH）液相色谱纯5.2.4抗生素标准储备液，ρ=1000mg/L准确称取10.0mg抗生素标准样品，用甲醇（5.2.3）溶解并定容到10mL的棕色容量瓶中，配制成1000mg/L抗生素的标准储备溶液，制备的标准贮备液于－20℃以下冷冻、密封、避光保存，保存期5.2.5抗生素标准使用液，ρ=10.0mg/L取抗生素标准贮备溶液（5.2.4）1.00mL于100.0mL容量瓶中，甲醇定容，混匀，配制成标准使用溶液。于－20℃以下避光保存，保存期为90d。5.2.6抗生素内标储备液，ρ=100.0mg/L内标物推荐13C6-磺胺吡啶和环丙沙星-d8，也可使用其他性质相近同位素物质。用甲醇（5.2.3）作为溶剂配制，制备的标准贮备液于-20℃以下冷冻、密封、避光保存，保存期为180d。5.2.7抗生素内标使用液，ρ=1.0mg/L移取适量内标贮备液（5.2.6用甲醇（5.2.3）稀释，于-20℃以下避光保存，保存期为90d。6仪器和设备除非另有说明，分析时均使用符合国家标准A级玻璃量器。实验所涉及的玻璃器皿都经过甲醇和超纯水的彻底洗涤。4T/LNEMA019—20246.1液相色谱仪液相色谱仪：具紫外检测器或二极管阵列检测器。色谱柱：填料为5μmODS，柱长25cm，内径4.6mm的反相色谱柱，或其它等效色谱柱。6.2高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：高效液相色谱具备梯度洗脱功能，质谱仪配有电喷雾离子色谱柱：C18柱或其他等效色谱柱，柱长50mm，内径2.1mm，填料粒径1.7μm，或其他等效色谱柱。6.3微量进样器微量进样器：10µL、50µL和100µL。6.4滤膜滤膜：孔径0.22µm醋酸纤维滤膜、亲水性聚丙烯、亲水性聚四氟乙烯（PTFE）或其他等效材质。6.5分析实验室通用仪器设备一般实验室常用仪器和设备。7DGT装置的准备（1）采用HLB-DGT装置。该装置结合相由通用型HLB填料掺杂于聚丙烯酰胺凝胶中制备而成，扩散膜是琼脂糖凝胶，厚度分别为0.5mm，0.8mm，1.0mm和1.4mm，滤膜是聚醚砜(PES)。（2）DGT装置在室温下保存，已开封包装的DGT装置可放在装有少量0.01MNaCl溶液的自封袋中，保持袋中湿润，并定期检查。（3）为防止装置受到污染，使用前勿使装置长时间暴露空气中，勿用手或其他物品接触DGT装置暴露窗口。（4）装置投放前，充氮气16h以上。8水体中抗生素的测定步骤8.1DGT装置的投放8.1.1已采集的水样采集的水样装到20L左右的容器中，将已准备好的DGT装置放置到容器中固定，保持装置的采样窗口朝向水体，并不断搅动水体（搅拌）。放置一段时间（60h）。8.1.2现场投放（1）将DGT装置六个为一组固定在有机玻璃投放器上，然后将投放器放置到指定的采样点没入水中，用绳子固定。（2）在投放器的尼龙线末端系上浮标，确定投放地点的位置，同时进行GPS定位。记录投放时间，测定水温、水深、电导率、pH等常规参数。（3）DGT装置在水体中一般持续放置7天。5T/LNEMA019—20248.2DGT装置的回收和保存8.2.1已采集的水样取出DGT装置，用去离子水冲洗装置的外表面，取出结合相后装入自封袋内，滴入几滴去离子水保湿后，密封保存待分析。8.2.2现场回收通过GPS和浮标找到DGT装置位置，取出DGT装置，用去离子水冲洗装置的外表面，取出结合相后装入自封袋内，滴入几滴去离子水保湿后，密封保存待分析。8.3DGT采集样的分析8.3.1DGT结合相提取从DGT装置中取出的固定相放到10mL离心管中，使用甲醇/乙酸(9:1v/v)混合溶剂5mL洗脱两次的方式洗脱回收的DGT结合相，洗脱后取出固定膜，保存洗脱液待测定。8.3.2提取液的测定DGT洗脱液加入一定量内标物，经过氮吹浓缩至近干，复溶于1mLLC-MS/MS初始流动相溶液中，过0.22μm的PES滤膜后，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定抗生素。9结果计算9.1结合相上吸附痕量有机污染物质量的计算吸附量（M,单位µg）的计算按照方程（1）进行计算：Ce为提取液中目标物的浓度，Ve为洗脱液体积，Vg为结合相体积，fe为目标物的洗脱率。9.2DGT平均浓度（CDGT）的计算式中：∆g为扩散层厚度（cmD为痕量有机污染物在扩散层中扩散系数(cm2·s-1)，A为扩散相的开口的面积，t为DGT装置的放置时间。9.3扩散紊流边界层（DBL）的计算DGT用于测定水中自由态离子的浓度存在扩散边界层δ,所以水体中应用DGT时至少需要放置2种不同厚度扩散膜组成的DGT装置，从而可应用下列公式得到两个方程，其中δ和Cb为未知数，解方程得到δ的厚度和目标物的浓度：6T/LNEMA019—2024（3）式中：M为单位时间内的累积量，∆g是扩散膜厚度，As指有效采样面积，t指DGT投放时间，Dg指扩散膜的扩散系数，Ag指DGT窗口暴露面积，Dw指水体扩散系数。9.4方法检出限本标准的方法检出限（MDL）测定步骤如下：1)仪器定量限（LOQLOQ是基于HPLC-MS/MS仪器十倍的信噪比S/N计算得出。2)方法检出限（MDLMDL是将DGT装置部署于空白溶液中采样7天后测得的LOQ，代入公10精密度和准确度10.1精密度的计算连续测量同一有证标准样品6次，用式（4）计算标准偏差Sn：X——n次测量的算术平均值；Sn——n次测量的标准偏差；相对偏差RSD用式（5）计算：本标准规定3种浓度水平的平行样品测试结果(≥6次）相对标准偏差应小于20%。10.2准确度的计算准确度通过测定加标回收率来计算，选择一个有证标准样品进行加标，重复测定6次，回收率按式（6）计算：（6）式中：∆X%——加标回收率；X——测定平均值；7T/LNEMA019—2024Xb——样品本底值Xs——标准值。本标准规定3种浓度水平的样品加标回收率测试结果，回收率应在75%～120%之间。11废物处理实验中产生的废物应分类收集，统一保管，并做好相应标识，委托有资质的单位进行处理。8T/LNEMA019—2024附录A（规范性附录）琼脂糖扩散膜在25℃下的扩散系数本标准中DGT方法以琼脂糖叠加PES滤膜作为扩散层，抗生素在琼脂糖扩散相内的扩散系数通过扩散室法进行测定(图1.1)，扩散室包括A室和B室，两室通过琼脂糖扩散相和聚醚砜滤膜相连，测定时，A室放置有装有50mL含5mgL-1抗生素溶液(以0.01molL-1NaCl作为背景溶液)，B室仅放置0.