胚胎干细胞的鉴定职业教育医学生物技术专业教学课件

职业教育医学生物技术专业教学资源库胚胎干细胞的鉴定职业教育医学生物技术专业教学资源库1、ES细胞生物学特性（1）ES细胞形态结构及核型ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了二倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。

职业教育医学生物技术专业教学资源库（2）ES细胞生长特性ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。

ES细胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。职业教育医学生物技术专业教学资源库（3）ES细胞的高度分化潜能ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”

“囊状胚体”

细胞分化物。ES细胞可进行诱导分化

*用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞，

*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。

*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。

*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。职业教育医学生物技术专业教学资源库

（4）碱性磷酸酶的表达

许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。职业教育医学生物技术专业教学资源库

（5）胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达

早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA-1的表达。小鼠SSEA-1的表达自8细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。职业教育医学生物技术专业教学资源库2、ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：

①形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；

②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞系混杂的集合体、具有三个胚层组织；

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③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；

④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。职业教育医学生物技术专业教学资源库3、ES细胞的鉴定--细胞的形态结构--核型分析--碱性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫荧光标记--分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成试验核移植试验职业教育医学生物技术专业教学资源库

（1）ES细胞形态学鉴定依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。职业教育医学生物技术专业教学资源库

（2）核型分析

ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验职业教育医学生物技术专业教学资源库

（3）碱性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在碱性条件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚钠水解，产生α-奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。步骤：生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室温5-10min→水洗10min→复染（甲基绿等）10min。结果：未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。对照：以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。

职业教育医学生物技术专业教学资源库职业教育医学生物技术专业教学资源库（4）胚胎干细胞特异表面抗原的表达免疫荧光检测SSEA胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分离的hES阴性弱阳性强阳性Gearhart分离的hES阳性弱阳性阳性小鼠ES阳性阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。职业教育医学生物技术专业教学资源库（4）胚胎干细胞特异表面抗原的表达RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达

Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子Oct-4，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。职业教育医学生物技术专业教学资源库职业教育医学生物技术专业教学资源库（5）分化能力检测体外分化能力观察:无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：3d“简单类胚体”

5-10d“囊状胚体”

贴壁细胞为细胞分化物。职业教育医学生物技术专业教学资源库体内分化能力观察：ES细胞接种同一品系小鼠腹股沟（107个细胞）或裸鼠、SCID小鼠（106个细胞）→约2周后出现肿块，4-5周进一步增大，摘除肿块→固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构裸鼠和SCID小鼠可接种异种细胞和组织的移植也可接种腹腔，2-3周后观察肿瘤职业教育医学生物技术专业教学资源库嵌合能力测定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化体小鼠（BALB/c小鼠）或纯合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）着床前胚胎内，或将来源于白化体小鼠的ES注射野灰色小鼠或纯合非野灰色小鼠着床前胚胎内，再移植到假孕母鼠子宫内，使之发育成个体。如