基于环境DNA的长江水生生物监测与完整性评价技术导则(编制说明)征求意见稿

《基于环境DNA的长江水生生物监测与完整性评价技术导则》编制说明（征求意见稿）i 2 2 2 3 6 6 6 7 8 8 9 11.1任务来源），1.2起草单位和主要起草人1.3工作过程2024年1月，依托国家重点研发计划课题——“水生态系统完整性技术体2024年4月，标准编制组向重庆市环境科学学会申请团体标准立项。同月16日，重庆市环境科学学会组织召开了标准开题论证会，经编制组汇报与专家22标准制订的必要性2.1管理支撑系和评价体系”。“十四五”重点流域水生态环境保护规划要求在长江、辽河、海2.2技术进步现行标准和技术规范不足以支撑长江水生态环境管理和生物完整性保护工外，通过形态学鉴定的方法进行水生物种监测具有多种局限性1）采样要求差2）分类鉴定过于依赖专家的经验，对研究人员的经验要求较高，质控困难3）在生活史早期阶段的部分生物类群以及特定发育阶段的生物往往难以3于水生生物多样性监测中[2]。相对于传统的形态学监测方法，环境DN检测群落多样性4）流程的标准化程度高，易重复，便于质量控制。因此，3国内外研究进展3.1国外研究进展的淡水珍珠贻贝调查中，对目标物种难以发现和识别。2017年Charise等大麻哈鱼（Oncorhynchustschawytscha）[7]，在日本桂川河流域检测到日本大鲵4研究中很多方法针对某个物种而研发相应的特异性PCR引物，对环境中目标物种的DNA进行针对性扩增以检测到该物种的存在。Antoinette等在佛罗里达水域展开对入侵种缅甸蟒（Burmesepython）[11]监测方法的研究，研究者们开发出年MatthieuLeray和NancyKnowlton在对Virginia和Flori生物群落结构的研究中使用COI基因为特异性识别片段[12]，利用DNA条形码技在环境DNA技术标准化方面，国际上已经制定了基于环境DNA的生物监采样、实验手册》。2020年，瑞士环境署颁布了联合苏黎世大学等单位发布了（COST）出台了《环境DNA生物评估方法指南》。2022年，澳大利亚政府农业、渔业和林业部门倡议制定了《环境DNA生物监测手册》《环境DNA检测53.2国内研究进展会团体标准《淡水生物监测环境DNA宏条形码法》（T/CSES81—2023）、中148—2024）、北京市地方标准《鱼类贝类环境DNA识别技术规范（DB11/T2023—2022）》、辽宁省地方标准《水质DNA条形码鉴定底栖动物（DB21/T3.3前期研究成果申请环境DNA专利5项，发表环境DNA相关学术论文十余篇，较为全面的揭示了长江水生生物完整性状况，为长江水生态保护64编制原则和技术路线4.1编制原则（2）合理性：总结现有文献资料及环境DNA监测技术的基础上，可操作4.2技术路线7专家咨询吸取专家意见专家咨询标准开题会吸取专家意见标准开题会标准审查会吸取专家意见标准审查会吸取专家意见标准审查会5标准主要技术内容5.1总体框架第3章：术语和定义。规定了本标准中使用的5个关键的术语和定义。8第5章：基于环境DNA的长江水生生物监测。规定了如何基于环境DNA5.2适用范围围内，对水生生物进行监测与生物完整性的评价，其他流域可参照使用。环境5.3规范性引用文件95.4术语和定义本部分针对本标准中关键的5个术语和定义进行了规定，具体如下：本定义综合参考了《淡水生物监测环境DNA宏条形码法》（T/CSES81—2023）团体标准与期刊论文[18]的表的生物遗传物质（DNA）。期刊论文[18]中将环境DNA定义为：环境DNA指从水、沉积物、土壤、粪便、空气等环境介质中提取的各种生物的全部DNA，可获得多种生物多样性信息。本标准针对二者进行优化整合，保留二者对“环境介质”的开放性描述，如水、土壤、沉积物、生物膜、空气等，吸纳期刊论文定义定义为：生物体细胞核或者细胞器中能够代表该物种的标准的、有足够易扩增的短DNA序列，可用于生物的识别和鉴定。期刊论文[19]中阐述DNA条义中“足够变异”的模糊表述，避免因变异阈值不清导致的物种误判；保留“细胞核或细胞器”来源描述，同时通过“特定的、标准的短行中的每个样本都是不同的，并使序列能够在操作分类单元（operationaltaxonomicunit）：DNA条形码技术中，高通量2358-2024）当中对操作分类单元的术语定义：测序数据按照一定的序列相似性大规模测序技术。5.5工作程序参照国际最新研究成果以及发布的相关技术规范，本标准规定基于环境DNA的长江水生生物监测与完整性评价步骤分为环境DNA监测和完整性评价评价包括评价指标、指标赋分方法和评价步图2基于环境DNA的长江水生生物监测和完整性评价技术流程5.6基于环境DNA的长江水生生物监测境DNA在环境水体中有丰富的分布，因此这几个类群环境DNA的采样介质可DNA的浓度也高于水体。因此，结合《长江流域水生态监测方案（试行）》中表1水生生物类群及其环境DNA采样介质水生生物类群常用采样介质适用水体类型鱼类水体河流、湖库大型底栖无脊椎动物表层沉积物河流、浅水湖泊浮游动物水体湖泊重点保护水生生物根据栖息环境确定有重点保护水生生物分布的水体参照《水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行）》和《水生物的DNA，导致环境DNA出现假阳性，因此，采样点位的布设主要参照《地表水环境质量监测技术规范》（HJ91.2）执针对长江流域制订，因此，点位的布设可结合长江水生态考核办法规定的50个），位和92个重点湖泊点位）确定（见表3），也可根据需要自行确定采样范围和序号省份水体类型水体重点保护水生生物物种数1青海河流长江干流（青海）32长江干流（四川）243赤水河（四川）4岷江215嘉陵江（四川）6沱江7雅砻江8西藏长江干流（西藏）59云南长江干流（云南）24云南赤水河（云南）7重庆长江干流（重庆）重庆嘉陵江（重庆）21重庆乌江（重庆）贵州赤水河（贵州）9贵州乌江（贵州）贵州清水江甘肃7甘肃嘉陵江（甘肃）21湖北长江干流（湖北）2420湖北汉江（湖北）21湖南长江干流（湖南）2422湖南湘江2223湖南资江324湖南沅江2225湖南澧水526江西长江干流（江西）2427江西赣江928汉江（陕西）29嘉陵江（陕西）2130河南丹江（河南）/31广西湘江西源/32安徽长江干流（安徽）33江苏长江干流（江苏）34浙江东苕溪135浙江西苕溪136上海长江干流（上海）37上海黄浦江338云南湖泊滇池639贵州草海/40湖北洪湖/41湖南洞庭湖42江西鄱阳湖643安徽巢湖/44江苏太湖/45江苏淀山湖—元荡（江苏）/46上海淀山湖—元荡（上海）/47重庆水库三峡水库（重庆）948湖北三峡水库（湖北）949湖北丹江口水库（湖北）550河南丹江口水库（河南）5表3长江流域水生生物监测位点清单序号点位名称1直门达97.248133.0219河流2通天河大桥95.826634.0358河流3庚卓如瓦96.962233.3438河流4洛须镇温托村98.997529.7111河流5江达具邓科乡97.981132.4644河流6江达县波罗乡98.602031.1879河流7金江桥26.1838河流8五孙庙26.5654河流9金沙江树底桥27.0058河流龙洞26.5384河流新华99.958326.9331河流三块石28.6317河流倒流子28.4728河流黄沙坡28.6469河流洗白27.4996河流岔河渡口27.7147河流洛甸河水文站27.6859河流金沙江岗托桥98.596731.6178河流倮果26.6010河流20石门子28.7406河流21水磨沟村99.055029.9381河流22挂弓山28.7815河流23江南镇沙嘴上28.7849河流24纳溪大渡口(左岸)28.7488河流25手爬岩28.8950河流26沙溪口28.8813河流27蒙姑26.5719河流28贺龙桥99.389228.1706河流29拉鲱26.3652河流渭门桥31.7589河流镇平乡32.1636河流悦来渡口29.7273河流岷江青衣坝29.4974河流凉姜沟28.7799河流彭山岷江大桥30.2114河流岷江东青交界29.9044河流映秀31.0456河流岳店子下30.3575河流河口渡口29.1419河流40月波29.0423河流41雅砻江口26.6120河流42雅江县城上游29.2033河流43呷拉乡雅砻江99.978831.6115河流44柏枝沙滩27.1095河流45长须干马乡99.006132.7519河流46沙溪(底)31.6200河流47金溪电站31.1572河流48上石盘32.3890河流49金子30.2134河流烈面30.5035河流元西村32.5368河流伍嘉码头30.9585河流新政电站31.3108河流小渡口30.7336河流麻柳包31.4010河流醒觉溪28.8045河流宏缘30.6033河流拱城铺渡口30.0608河流大磨子28.9678河流李家湾29.1044河流老翁桥29.2658河流银山镇29.6872河流幸福村(河东元坝)29.9614河流脚仙村29.4413河流沱江大桥(底)28.8849河流和尚山29.5076河流江津大桥29.2670河流寸滩29.6180河流丰收坝29.3949河流沙溪镇29.7129河流北温泉29.8368河流井口(嘉陵江右岸)29.6633河流大溪沟29.5705河流梁沱(左岸)29.6012河流长江涪陵菜场沱29.7115河流麻柳嘴29.5955河流锣鹰29.3867河流江口镇烂泥坨29.2818河流鹿角29.1333河流大关桥26.8673河流六广27.0067河流乌江下五龙27.3012河流大乌江镇27.4009河流乌杨树27.9969河流沿河28.6225河流清池27.7390河流黄歧坳27.7817河流茅台27.8603河流九龙囤28.2917河流鲢鱼溪28.6078河流茶园岔河26.3604河流兴仁桥26.3247河流下司26.4944河流旁海26.7482河流茅坪26.7476河流崔家25.5236河流大冲口25.7272河流大源屋26.0130河流白果村26.2509河流白龙江两河口桥33.6975河流姚渡32.7865河流洛大33.9797河流固水子村33.3280河流33.6034河流站儿巷33.7820河流烈金坝33.0438河流老君关32.7156河流黄金峡33.1934河流南柳渡33.1118河流兰滩32.8794河流八庙沟32.8315河流鲁光坪33.3117河流黄牛铺34.1950河流灶火庵33.9021河流凤州33.9567河流淅川史家湾33.0805河流荆紫关丹江河桥33.2533河流寺湾镇丹江河桥33.1605河流沈湾32.4650河流白家湾32.0584河流仙人渡32.2259河流陈家坡32.8046河流罗汉闸30.6898河流皇庄31.1851河流黑流渡30.5411河流转斗31.4598河流余家湖31.9142河流汉南村30.4045河流石到30.4183河流小河30.6805河流石牌港30.9930河流岳口30.5010河流宗关30.5772河流云池(白洋)30.4310河流调关29.6982河流柳口29.9714河流砖瓦厂30.2848河流观音寺30.2322河流荆江口29.4664河流南津关30.7687河流白浒山30.5484河流纱帽30.3083河流黄盖湖镇右29.8661河流中官铺29.8443河流风波港(右岸)30.2143河流刘佐(左岸)29.8233河流燕矶30.4067河流桑植打鼓泉渡口29.4551河流永定澄潭(区水厂)29.1253河流张公庙29.6008河流澧水三江口29.5884河流窑坡渡29.5937河流永定潭口29.1897河流沙河口29.2600河流大夫庙26.2790河流港子口26.5032河流归阳镇26.5371河流新塘铺26.7780河流城北水厂26.9122河流鱼石村26.9792河流樟树港28.5686河流熬洲27.3281河流桔子洲28.1678河流昭山27.9720河流马家河27.8489河流诸葛庙26.2068河流五强溪28.7746河流浦市上游28.0852河流陈家河(四水厂)28.9848河流武水汇合口28.2866河流侯家淇28.4107河流27.1486河流坡头28.9130河流城陵矶(右岸)29.4833河流天字一号29.6978河流陆城29.6083河流江南镇29.7631河流君山长江取水口29.4825河流桂花渡水厂27.2074河流桃谷山28.5419河流球溪27.6024河流万家嘴28.6168河流新化水厂27.7194河流晒谷滩电站27.3300河流坪口28.0478河流临资口28.7000河流瓦石矶28.7139河流株溪口28.3986河流新庙前25.9953河流青原七姑岭26.9731河流新干车头27.6854河流生米28.5417河流丰城小港口28.2619河流吴城赣江29.1884河流周坊28.7864河流吉里28.7783河流马当渡口29.9917河流湖口(右岸)28.7783河流彭泽红光村29.8592河流200九江县大屋何29.8381河流201陈家墩(右岸)31.0784河流202皖河口(左岸)30.4892河流203前江口(左岸)30.5734河流204五步沟(右岸)30.8063河流205民生水厂(右岸)30.6789河流206三兴村(底)31.7788河流207元宝圩(左岸)30.9985河流208东西梁山31.5014河流209乌江(左岸)31.8425河流210塘浦30.6459河流211荆湾30.8288河流212铁路桥30.8817河流213新港口30.9401河流214递铺30.6529河流215汪家埠30.2572河流216城南翻水站30.5314河流217东升30.6547河流218城西大桥30.8652河流219毗山30.8784河流220团结闸31.7915河流221高港码头(左岸)32.2851河流222小河口上游(左岸)32.2429河流223焦山尾(右岸)32.2264河流224浏河(右岸)31.5468河流225魏村(右岸)32.0070河流226九乡河口32.1780河流227下青龙港32.0512河流228小湾(右岸)31.9401河流229启东港31.7483河流230朝阳农场31.1722河流231崇明东滩(左岸)31.3911河流232东风西沙31.7048河流233白龙港(右岸)31.3092河流234青草沙进水口31.4908河流235淀峰31.0897河流236夏字圩30.9723河流237闵行西界30.9794河流238吴淞口31.3836河流239临江31.1127河流240草海中心24.9917湖泊241灰湾中24.9136湖泊242罗家营24.8900湖泊243观音山东24.8372湖泊244观音山中24.8372湖泊245观音山西24.8372湖泊246海口西24.7733湖泊247滇池南24.7064湖泊248白鱼口24.8100湖泊249断桥25.0150湖泊250草海杨关山26.8742湖泊251草海中部26.8515湖泊252朱家湾子26.8335湖泊253万下河口26.8548湖泊254刘家巷26.8491湖泊255洪湖湖心A29.8396湖泊256杨柴湖29.7936湖泊257排水闸29.8281湖泊258洪湖湖心B29.8817湖泊259小港29.9284湖泊260王垸村29.8821湖泊261下新河29.9477湖泊262洪湖5#29.8760湖泊263桐梓湖29.8118湖泊264鹿角(洞)29.1541湖泊265扁山29.3380湖泊266东洞庭湖29.3300湖泊267洞庭湖出口29.4429湖泊268横岭湖28.8375湖泊269虞公庙28.8297湖泊270岳阳楼29.4027湖泊271蒋家嘴28.8631湖泊272万子湖28.8184湖泊273南嘴29.0630湖泊274小河嘴28.8516湖泊275东洞庭湖湖心29.2454湖泊276主湖体129.4279湖泊277主湖体429.2062湖泊278磊石山28.9722湖泊279莲湖29.0215湖泊280康山28.9406湖泊281南矶山28.9924湖泊282伍湖分场29.0559湖泊283青岚湖28.4913湖泊284三山29.1498湖泊285星子29.4447湖泊286老爷庙29.3730湖泊287蚌湖29.2842湖泊288鄱阳湖出口29.7272湖泊289蛤蟆石29.6090湖泊290都昌29.2455湖泊291梅溪咀28.8000湖泊292白沙洲29.1233湖泊293湖滨31.6461湖泊294黄麓31.5778湖泊295新河入湖区31.5674湖泊296西半湖湖心31.6527湖泊297龟山31.6019湖泊298东半湖湖心31.5220湖泊299忠庙31.5658湖泊300兆河入湖区31.4726湖泊301天灯村31.5900湖泊302炯炀31.6343湖泊303花塘31.5606湖泊304余家墩31.4800湖泊305南淝河入湖区31.6862湖泊306孤山31.6021湖泊307派河入湖区31.6607湖泊308梅梁湖心31.4686湖泊309锡东水厂31.4478湖泊310沙渚南31.3789湖泊竺山湖心31.3909湖泊312兰山嘴31.2167湖泊313胥湖心31.1717湖泊314乌龟山南31.3103湖泊315西山西31.1347湖泊316拖山31.3919湖泊317椒山31.3333湖泊318漫山31.2328湖泊319平台山31.2258湖泊320十四号灯标31.0628湖泊321泽山31.0136湖泊322大雷山31.1364湖泊323五里湖心31.5131湖泊324大浦口31.2967湖泊325东太湖31.0933湖泊326元荡31.0700湖泊327千灯浦口31.1876湖泊328新华港31.1383湖泊329汪洋荡31.1406湖泊330淀山湖中31.1200湖泊331急水港口31.1039湖泊对于环境DNA的水样，采用滤膜过滤的方式采集环境DNA仍然的方式，滤膜的孔径大小目前文献中没有统一，一般情况下0.45微米的滤膜适），）；大程度的捕获环境DNA，因此，在具备条件的河流断面，可采用立体采品，在DNA提取之前需进行预处理。根据选择的DNA提取方法，必要时以抽解液将滤膜振荡破碎；对于沉积物样品宜将样品均DNA提取后，应对其浓度和质量进行检测。一般用于后续间，OD260/230应大于2.0，否则表明DNA纯度不足，可能有蛋白质、RNA或测到隐性或难以采集的物种。纯化则是为了去除PCR扩增过程中可能出现的非（一般6～8bp）。推荐引物可参照T/CSES81—2023或相关文条形码基因的扩增产物用1%～2%的琼脂糖凝胶电泳检测，应呈现单一清表4中华鲟和长江江豚条形码基因扩增引物引物序列（5,-3,）鲟ND4YFPDloop-F段克隆到载体中，形成一个可以长期保存并且能够代表原始样本基因信息的DNA文库。文库构建的主要目的是为后续的高通量测序、功能分析以及基因组学研究提供系统化的DNA资源。通过构建文库，可以获得一个包含多种不同DNA片段的集合，这些片段能够全面、准确地代表整个样本的遗传信息，为后文库构建包括混库、末端处理、接头连接、混库是将使用同一个引物进行PCR扩增的所有产物等比例混库，混库可以段进行磷酸化和3端添加dA尾，以产生黏性末端。配PCR仪给末端处理产物连接接头。接头的文库长度可通过基于电泳分离原理的设备进行检测，确保文库的长度符合预期。），高到>Q30等，将进一步提高测序正确率，但同时也会剔除掉更多的个样本的OTU统计表由OTU名称、序列、物种注释的分类信息（门、纲、目、个技术重复以增加结果的确定性2）在生物信息学分析过程中，对于同一批有疑义时回溯3）假阳性与假阴性是经常可能出现的问题，在物种注释时，升结果的可信度，为后续监测、长期数据对比和区域间数据共享提供有力保障，具体措施包括1）所有采样工作遵循标准化采样流程，使用无菌技术采集样实验场所应满足分子生物学实验室的各项条件，如，PCR产物因操作不当极容易引起气溶胶污染，会影响实验结果准确性，因此应将PCPCR产物纯化检测区进行强制性物理隔离。另外，实验前应对实验室环境（实验台、仪器设备、实验耗材等）消毒灭菌，避免污染和交叉污染。（3）详实记5.7水生生物完整性评价IBI在实践中操作简便，能够为管理者提供定量化、标准化的评估依据，水生生物分别建立IBI。在我国发布的技术文监测与评价（试行）》（HJ1295—2023）和《水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）》（HJ1296—2023）两项技术规范中，规定的定指标参考值、指标赋分、水生生物完整性指数最终得进行评估，包括人类活动的干扰强度、河湖/库的物理这一方法的实施旨在确保在不同区域能够根据惯例。对于重点保护水生生物，指的是国家I级和II级重点保护水生生物，则参照长江水生态监测方案和农业农村部的技术文件，以物种种类数比例对生物完整性进行评价。各项指标的赋分标准采用百分制，也主要参考农业农村部技术文件确定。在对生物完整性进行分级评价之前，首先需要对各项指标的赋分进行综合对比决定取舍原则。依据农业农村部文件，单一生物类群的不同指标，以得最低分的指标分值为准；不同生物类群的分值综合起来进行最终评价时，则取分值的算术平均值作为最终分值。这一方面考虑了保守的生态环境保护理念，另一方面，也考虑了不同生物类群完整性评价的均衡性，结论更为科学。评价分级的标准则按照百分制，每20分一个等级，分为优、良、中、差、劣五个等级，这种分级方法也较为常见，主要参考了农业农村部技术文件、生态环境部技术文件以及广东省生态环境厅于2021年发布的《广东省江河湖库水生态环境调查与评价技术指引（试行）》中的分级方法。6标准实施建议6.1确保资源和技术准备充分6.2加强质量控制和质量保证体系建设括采样、DNA提取、扩增、测序等）的质量达到规6.3加强培训与能力建设EnvironmentalResearch.2023;239.DNAfromsediments[J].JournalofMicrobiologicalMethods.1987;unsaturatedbiofilms[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2005;71(9):5404-10.MicrobialCommunities[J].Science.2005;308(5721):55(eDNA)asadetectiontoolforat‐riskfreshwaterpearlymusselspecies(Bivalvia:Unionidae)[J].AquaticConse2018;28(3):545-58.2022;4(2):339-48.Japanesegiantsalamander(Andriasjaponicus)distributioninwesternJapanusingmulti-copynuclearDNAmarker[J].Limnology.2024;25(2):18quantificationofthe