医学资料 医学免疫学实验免疫标记技术 (2) 学习课件

医学免疫学实验免疫标记技术免疫标记技术

概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。

特点：敏感、特异、快速，

定性、定量、定位。★免疫印迹技术(westernblot)★斑点金技术★放射免疫技术★酶免疫技术（ELISA）★免疫荧光技术常用免疫标记技术：直接免疫荧光荧光素直接标记抗体,检测抗原。AgYFluorochromeLabeledAbTissueSection常用的荧光素主要有：异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色藻红蛋白(PE)：桔红色罗丹明（RB200)：红色免疫荧光技术：直接免疫荧光，间接免疫荧光间接免疫荧光,一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。AgYYFluorochromeLabeledAnti-IgTissueSectionUnlabeledAb高效、更灵敏2.经济、通用性强一抗：二抗：以兔源一抗为例

兔源一抗

木瓜/胃蛋白酶

抗体Fc段（为抗原）

人蛋白：1，2，3

……兔/鼠：

抗体1，2，3

………羊（驴）（二抗）免疫动物产生抗体多抗/单抗兔源/鼠源抗人抗原种特异性：一个羊源二抗可识别所有兔源一抗，即一个二抗分子可识别一种动物源的所有一抗。

羊抗兔/鼠；驴抗兔/鼠免疫羊产生抗体恒定区可变区人工制备抗体的类型

多克隆抗体

抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），含有针对不同抗原决定簇的多种抗体分子。Ag6抗原决定簇单克隆抗体（mAb)

Köhler和Milstein1975年建立的技术，通过杂交瘤技术获得的针对单一抗原决定簇的高特异性抗体。78抗原加工提呈，抗原肽免疫荧光技术抗C3二抗补体结合位点见前所述Fluorochrome藻红蛋白(PE)：桔红色定性、定量、定位。（工业化生产）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37C，20-30min双抗体夹心法

SandwichELISATMB/OPD+H2O2概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原酶联免疫吸附试验

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)加酶结合物(酶结合二抗)显色:每孔加显色液A、B各1滴，混匀，封板，37C，15min免疫荧光技术：直接免疫荧光，间接免疫荧光概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原第5孔，待检血清2，加待检血清1滴酶直接标记一抗异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色酶联免疫吸附试验

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)藻红蛋白(PE)：桔红色定位：对某蛋白质在细胞的定位、定量（细胞质中表达）荧光染料共定位：对某二个蛋白质在细胞内的定位、定量免疫荧光可“定位”、“定性”，借助图像软件可进行模拟“定量”分析；酶标记技术免疫组织化学：“定位”“定性”、“模拟定量”；免疫印迹（Westernblotting）：“定性”、“模拟定量”；酶联免疫吸附试验（ELISA）：“定量”辣根过氧化物酶碱性磷酸酶(OPD)邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺(TMB)+H2O2有色物质直接法

directELISA检测抗原：

酶直接标记一抗辣根过氧化物酶(HRP)TMB/OPD+H2O2有色物质抗原一抗邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺(TMB)酶联免疫吸附试验

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)双抗体夹心法

SandwichELISA检测抗原：有两个一抗。固相载体：聚苯乙烯微量反应板辣根过氧化物酶(HRP)间接法

indirectELISA病人血清固相载体：聚苯乙烯微量反应板（工业化生产）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，二抗：

抗人IgM或IgGFc段抗体如：检测乙肝表面抗体(HBsAb)①②加病人血清③辣根过氧化物酶(HRP)包被洗涤洗涤(可省)洗涤(不可省)有色物质二抗过量时，加入病人血清后，要不要洗涤？邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺(TMB)TMB/OPD+H2O2预包被板加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37C，20-30min直接法

directELISA第1孔，空白对照，加洗涤液1滴直接法

directELISA（工业化生产）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，（工业化生产）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)，人蛋白：1，2，3……木瓜/胃蛋白酶异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），含有针对不同抗原决定簇的多种抗体分子。异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色辣根过氧化物酶(HRP)四甲基联苯胺(TMB)Köhler和Milstein1975年建立的技术，通过杂交瘤技术获得的针对单一抗原决定簇的高特异性抗体。加酶结合物(酶结合二抗)特点：敏感、特异、快速，医学免疫学实验免疫标记技术种特异性：一个羊源二抗可识别所有兔源一抗，即一个二抗分子可识别一种动物源的所有一抗。间接ELISA法检测血清抗-HBsAbTMB/OPD+H2O2TMB/OPD+H2O2抗人IgM或IgGFc段抗体异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色酶联免疫吸附试验（ELISA）：“定量”TMB/OPD+H2O2异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色第4孔，待检血清1，加待检血清1滴加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37C，20-30minFluorochromeTMB/OPD+H2O2双抗体夹心法

SandwichELISA木瓜/胃蛋白酶酶联免疫吸附试验

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISA)TissueSection加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37C，20-30min第1孔，空白对照，加洗涤液1滴直接法

directELISA洗板:弃去孔内液体，注满洗涤液，静置5sec甩干，重复3次。空白阴性阳性待测1待测2间接ELISA法检测血清抗-HBsAb

1.加血清及对照(一抗)

第1孔，空白对照，加洗涤液1滴 第2孔，阴性对照，加阴性对照血清1滴第3孔，阳性对照，加阳性对照血清1滴第4孔，待检血清1，加待检血清1滴

第5孔，待检血清2，加待检血清1滴

(不洗，因为二抗过量)2.加酶结合物(酶结合二抗)加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37C，2