3.2 基因工程的基本操作程序（第1课时）课件-【知识精研】高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序-1本节聚焦1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？从社会中来培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)基因工程的基本操作程序1、目的基因的筛选与获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定前提核心关键保证有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。基因的结构外显子内含子启动子原核真核RNA聚合酶识别结合的部位使转录停止终止子编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游外显子：能编码蛋白质的序列。内含子：不能编码蛋白质的序列1.定义：一.第一步：目的基因的筛选与获取2.目的基因主要是指编码蛋白质的基因抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因（一）目的基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。1.较为有效的方法之一从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.辅助工具

随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。一.第一步：目的基因的筛选与获取（二）目的基因筛选Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。3.实例：Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因Bt抗虫蛋白的抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？一.第一步：目的基因的筛选与获取一.第一步：目的基因的筛选与获取（三）目的基因获取方法1.人工合成3.利用PCR获取和扩增目的基因（常用）2.从基因文库中获取10011.人工合成在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。DNA合成仪转基因抗虫棉在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成（三）目的基因获取方法一.第一步：目的基因的筛选与获取根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成人工合成人工合成DNA序列可以说是一种从无到有的的合成。例如ATCG四核苷酸序列，先将G的5’端利用特定药剂进行保护，3’端暴露，然后加入3’端保护的C，并进行合成反应，这样就可以合成3’CG5’,然后去掉C的3’保护基团，再加入3’端保护的T，继续缩合形成3’TCG5’,这样依次进行，最后合成3’ATCG5’，这与PCR的原理是不同的。12012.从基因文库中获取（三）目的基因获取方法一.第一步：目的基因的筛选与获取基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库类型：基因组文库:部分基因文库:包含一种生物的全部基因（cDNA文库）包含一种生物的部分基因基因文库的构建PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。钱嘉韵第一个分离出Taq聚合酶。3.利用PCR获取和扩增目的基因（常用）（三）目的基因获取方法（1）PCR技术：全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）可以在短时间内大量扩增目的基因原理操作环境优点：01（三）目的基因获取方法一.第一步：目的基因的筛选与获取3.利用PCR获取和扩增目的基因（常用）参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种游离的脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸【回顾】DNA复制的基本条件②模板：DNA母链③原料：四种脱氧核苷酸(dNTP)01一.第一步：目的基因的筛选与获取（2）PCR条件：★①稳定的缓冲液（一般添加Mg2+，激活DNA聚合酶）④酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）⑤仪器：自动调控温度的仪器1）变性：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段第一步：变性3’3’5’5’3’5’3’5’变性90℃思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。（3）PCR过程：2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

与两条单链DNA结合。

第二步：复性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’碱基互补配对5’5’思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。3’3’（3）PCR过程：3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脱氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端（3）PCR过程：【引物】★1.PCR需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。引物结合在模板链的_________。3’端使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。2.引物的作用：3.引物的结合部位：3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2子链延伸方向5’3’★4、PCR扩增时至少需要______种引物，原因是：2①目的基因的两条链均要作为模板扩增；②两条链的碱基排列顺序不同。【引物】5.引物的化学本质：6.引物长度：20-30个核苷酸是一小段与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸;★7、PCR扩增的前提是：根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物【引物】（1）依据：目的基因的核苷酸序列8、设计引物：（2）注意：【典例】导学案P2①引物自身不能环化②两种引物之间不能互补配对③引物长度不宜过短，防止引物随机结合④引物在目的基因两侧【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。

第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效第二轮循环的产物第三轮的产物3’5’3’5’3’5’3’5’第一轮循环的产物3’5’3’5’【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。DNA扩增成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。①DNA分子有_____个②总链数_____条③不含引物的链数：___④含引物的链数_____⑤含引物1或2的链数：______⑥仅含引物1的DNA数：______⑦仅含引物2的DNA数：______⑧引物1、2均含有的DNA数：_____⑨不含引物的DNA数：______⑩需要引物的总数：______2n2n+122n+1-2循环n次：2n-1112n-202n+1-2★5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（）

D

（7）PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原则条件解旋方式酶特点碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、耐高温的DNA聚合酶、引物、稳定的缓冲液DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等（4）PCR技术扩增与体内DNA复制的比较：拓展：比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件在DNA复制中的作用体内DNA复制条件PCR反应条件DNA母链DNA母链解旋酶高温条件（90℃以上）4种脱氧核苷酸4种脱氧核苷酸DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶一小段RNA一小段DNA提供DNA复制的模板断裂氢键，打开DNA双链合成子链DNA的原料催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物）通常是20~30个核苷酸用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA01琼脂糖凝胶电泳思考：如何对PCR扩增的产物进行鉴定？DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳DNA混合物－最长最短琼脂糖凝胶电泳梳子模具根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。1将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。2待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。3点样孔电泳槽样品将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶1mm为宜。4将扩增得到的PC