生物技术工程（原卷版）3大模板-2025年高考生物答题技巧与模板构建

专题10生物技术工程

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模板01酶切位点的选择-既要相同又要不同

模板02双标记筛选金标准一二去其一是为真

~~~藏薛

朗•答题模板答题要点+答题技巧+模板运用

稼•高分突破模板综合演练，快速技巧突破

'〃/〃/〃〃/〃〃〃/〃〃//〃〃〃〃/〃〃//〃/

命题点真题在线常见设问/关键词

微生物的选

2023•山东・T152023•广东-TIO2023•北京-T162022•全国甲・T37

择培养和计

2022•全国乙・T372022・广东-T212021・江苏-T18

数

2023•广东-T122023•江苏-T132023・浙江1月选考-T24202141

植物体细胞

M-T11

杂交技术

2020•北京・T132020•山东-T13

2023•北京・T12

动物细胞融

2023•湖北-T222022•山东-T152022•福

合和单克隆设问关键词：限制酶

建.T13

抗体的制备的选择、目的基因的

2021•山东-T152021•江苏1112020•全国I-T38

鉴定、PCR过程

基因工程的

2023•全国乙・T382023•全国甲・T382023・湖北・T42023・广东-T20

基本操作程

2021•广东・T22

序

DNA片段的

2023•江苏-T222023•山东-T252023•浙江6月选考-T192022•辽

扩增与电泳

宁・T122022・江苏-T242021•山东-T252021•全国甲138

鉴定

几种不同2023•江苏-T222023•山东1252022•江苏1242022•山东125

PCR的应用2021•全国甲T382021•山东-T252020•北京-T122020•江苏-T33

命题预测基因表达载体的构建；标记基因的选择

目的基因和载体的酶切和连接是设计的核心；根据题目的具体信息判断保留和破坏的标记基

关键技巧

因的类型

////////〃/〃//〃//〃〃/〃///〃////〃///〃,◎客起操板“/〃〃////〃〃〃/〃/〃/////〃〃〃//////〃"

模板01酶切位点的选择-既要相同又要不同

购答题要点

【核心】相同黏性末端，正确连接方向

酶切位点的选择实际上有许多需要考虑的逻辑，但核心点是两个：

要保证质粒和目的基因的黏性末端相同，才能让质粒和目的基因的黏性末端相互连接。

要保证基因的头对着启动子，尾对着终止子，才能保证正确的转录。

除这两个原则之外，很多题目还会有额外的信息，如基因中间或质粒其他位置存在相同酶切位点、同尾酶

等，要根据题目信息具体判断。

【基本知识】

（1）限制性内切核酸酶（简称"限制酶"）

主要来源■原核生物

种类•分离的限制酶有数千种

特占识别双链DNA分子的特定核的酸序列,

（专二Q使每一条链中特定部位的磷酸二酯键

限断开

制

酶断开两个核甘酸之间的磷酸二酯键

［切割位置：识别序列的中心轴线两侧

黏性黑15-GAA；TTC3-_GAATTC

末埔|A之间3，CTT|AAG5，CTTAAG

结果〔切割）中立线

「切割位置：识别序列的中心轴线处

SmaIJ

平，|（在G与5，CCC|GGG3，CCCGGG

末端C之间if

回3'GGG|CCC5'GGGCCC

切割）\

中轴线

（2）限制酶的选择

PstISmaIPst1

1i।I

SmaI抗病EcoRI

基因

甲

1.不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst回，而不选择Sma队

2.保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量

不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma回。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记

基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的"假阳

性"（即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选）。

3.善用"双酶切"，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因

所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切

法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后

形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向（或描述为"RNA聚合酶的移动方向"）必须是相同的,

否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstI和EcoRI两种限制酶。

4.巧用"同尾酶"：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用

其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。

G答题技巧

技巧01酶切位点的选择-既要相同又要不同

研究人员为寻求炎症性疾病的高敏感检测方法，以重组S100A8蛋白作为免疫抗原，制备了抗S100A8蛋白

的单克隆抗体。下图是重组S100A8蛋白的制备过程，结合下表4种相关限制酶的识别序列和切割位点，可

知切割质粒的限制酶为（）

转录方向

（注：S100A8蛋白是炎症反应时高度表达的一种蛋白质，可作为炎症性疾病诊断的重要标志物。）

Hind回Neo团Bg唱Xho回

5'-A^AGCTT-3*5'-CJCATGG-3'5'-A^GATCT-3'5'-CJTCGAG-3'

A.HindIII和NcoElB.BglEI和XhoEl

C.NcolB和Xho0D.Hind回和Bgl0

【技巧点拨】【核心】相同黏性末端，正确连接方向-要保证质粒和目的基因的黏性末端相同，才能让质粒和

目的基因的黏性末端相互连接；要保证基因的头对着启动子，尾对着终止子，才能保证正确的转录。

【思路详解】依据题干信息，S100A8蛋白基因经切割后所产生的黏性末端为6CATG3，、5TCGA3，，依据表格

中限制酶的识别序列，可知，HindEI产生的黏性末端为5'AGCT3',NcoEl产生的黏性末端为5'CATG3'（与目的

基因一端的粘性末端能碱基互补），BglEI产生的黏性末端为5,GATC3',XhoEl产生的黏性末端为5'TCGA3,（与

目的基因另一端的粘性末端能碱基互补），为了确保目的基因和质粒的正向连接，防止自身环化，故应选择

两种能产生不同的黏性末端的限制酶，所以可选Neo团和Xho团进行切割质粒，C正确，ABD错误。

【答案】C

封模板运用

研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒，得到的DNA片段如图所示。图中DNA片

段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是（）

同时用酶M

某DNA分子牺迪匕飞和TGCACA和GCGCT

CACGTGTCGCGA

।।।।।।।।।।।_1

片段甲片段乙片段丙

盟用酶M和WN------------r------------r

由2处理GCGCTG*TGCACA

质粒----------------->和

ACACGTGTCGCG

Iiiiiiiiiiii

片段丁片段戊

A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点

B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系

C,用T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来

D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子

模板02双标记筛选金标准一二去其一是为真

⑥爸题票点

【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体

双标记让载体具有两个标记性状，如四环素抗性和青霉素抗性，在基因表达载体的构建中会破坏其中一个,

如破坏四环素抗性，含有目的基因的基因表达载体此时只有青霉素抗性，而空载体依然具有四环素抗性和

青霉素抗性，通过在培养基中添加四环素，可以区分出含有目的基因的载体和空载体。

1.标记基因的作用

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的

能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能抵抗相

应抗生素，所以在受体细胞的培养基中加入该种抗生素就可以只保留成功转入载体且抗生素抗性基因表达

的受体细胞。

2.双标记原理

（1）单标记的区分问题：仅有一个标记基因时，含有目的基因的载体和空载体都有标记，在筛选时无法区

分。

（2）双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性

基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素

抗性基因失活。

目标值各（农合如坏案■的为永氐上

不能生畏说明次标记鼠因被破坏）

理环案抗

重组载体

细蔑含氮节青霉素含四环素

的培养基的培养基

筛选方法：将细菌先放在含氨革青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组载体的细菌和含空载体的细菌,

如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布将上述5个菌落影印到含有四环素的培养基上，如上图,

能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图中1、5菌落。

最后，可在含氨茉青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

3.标记基因的作用：在宏观水平上看到微观分子的变化，例如抗生素抗性基因作为标记基因时，可以用抗

生素筛选出具有抗药性的菌落，从而快速对转基因的结果进行鉴定。标记基因本身也是一个能正常表达的

基因，具有自己的启动子和终止子。

4.受体细胞不同，标记基因种类也不同：受体细胞为细菌时，标记基因通常是抗生素抗性基因；受体细胞

为真核细胞，尤其是动植物细胞时，抗生素很多时候不能杀死未标记的细胞，无法起到筛选的效果，此时

标记基因通常选择荧光基因等。

€答题技巧

技巧02失去一个标记基因的载体才是好载体

（2023・湖北•高考真题）用氨芳青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetD作为标记基因构建的质粒

如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并

转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）

A.若用Hind回酶切，目的基因转录的产物可能不同

B.若用Pvu回酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用Sph团酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否

D.若用Sph国酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苇青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落

【技巧点拨】【核心】失去一个标记基因的载体才是好载体-双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗

性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。

【思路详解】A、若用Hind回酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正

确。

B、若用Pvu回酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR）,因此在含Tet（四环素）培养基中的菌

落，不一定含有目的基因，B正确；

C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构

建成功与否，C正确；

D、Sph团的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用Sph回酶切，重组质粒中含氨茶青霉素抗性基因（AmpR）,

因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苇青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成

菌落，D错误。

【答案】D

业模板运用

（2023・山西・高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两

端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位

点如图所示。

5'—GAATTC_3'5'—GGATCC_3'5'—CCCGGG—3'5'_AGATCT—3'

3'—CTTAAG—5'3'_CCTACp-5'3'—GGGjCCC_5f3'—TCTAGA—5(

tt

酶1酶2酶3酶4

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（）

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.DNA连接酶连接

B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接

C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接

D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接

//〃/〃/〃〃//////〃/〃〃〃〃〃〃〃〃/〃〃/@裔今突破〃〃〃〃〃〃/〃〃〃/〃/〃/〃〃〃〃〃〃//〃/

1.Sau3Al和BamHI的识别序列及切割位点如表所示。某DNA分子经Sau3AEI和BamHEI分别切割以后，可形

成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（）

限制酶名称识别序列和切割位点

BamHIGJGATCC

Sau3AIJGATC

A.两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同

B.能被Sau3AI识另IJ的DNA位点均能被BamHI识另lj

C.该DNA分子上有2个BamH团不能识别但Sau3A团能识别的酶切位点

D.该DNA分子经Sau3AEI和BamHEI共同切割后可形成6个片段

2.大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上

清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关

于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（）

1限制酶I

2限制酶n

3限制酶ni

A.提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解

B.将提取的DNA溶于2moi/LNaCI溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定

C.电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理

D.根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶I和团的切割位点，而有限制酶团的切割位点

3.BamHLMbol>Smal三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-GJGATCC-3'、5'JGATC-3'、5JCCCJGGG-3'。

下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（）

5z11111111ITMI।I«I；I111rMi111111rMi1111111113'

GGATCCCpfGGGCCCGGGGGATCC

CCTAGGGteCCCGGGCCCCCTAGG

3“山1山臼曲11山111111611111111115'

|<-------634bp--------------896bp--------*|«758bp------»|

A.若用Smal完全切割该DNA,则其产物的长度为634bp、896bp、758bp

B.若虚线方框内的碱基对被T-A替换，则用Smal完全切割该DNA可产生3种片段

C.若用Mbol和BamHI切割DNA,可形成相同的黏性末端

D.用Smal切割DNA产生的片段，可用E.coliDNA连接酶重新将其连接

4.从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2Qkb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所

用的限制酶是（）

EcoRI

图甲

A.②，BamHEB.①，EcoR0

C.①，EcoREI和HindEID.②，EcoRIB和HindEI

5.如图表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表

达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n分别是启动子和终止子。下表中是

可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（）

,NcoI

I

SUC2（（A））

I

Sau3AI突变型_3蛋白

BamHI酵母菌（疫苗）

目的基因S

a链

GATCCAF・CGGATCG・・GGC

GTA-GCCTAGC…CCGGTAC5，b链

限制酶BamH回Nhe团Neo团Sph0Sau3A0

识别序列和酶切位点5'-GjGATCC-3'5'-GjCTAGC-3'5'-CxPCATGG-3'5'-GCATG4/C-3'5'-UGATC-3'

A.过程①所需的酶是逆转录酶和DNA聚合酶

B.过程②所使用的两种限制酶是Sau3A回和Nco0

C.据图推测，目的基因S转录的模板链最可能是b链

D.SUC2可作标记基因，对导入B的酵母菌进行筛选

6.下列有关实验操作的说法，正确的是（）

A.克隆时，用Ca2+载体或蛋白酶合成抑制剂激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程

B.电泳时，将PCR产物与含有染色剂的凝胶载样缓冲液混合后，加入点样孔

C.提取DNA时，在研磨液中加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，弃去上清液

D.体外受精时，用高浓度的ATP溶液处理采集到的精子使其获能

7.由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因

接入载体E,图示为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（）

—CTGCJAS---------CCctoG----------GGTAct

—CTCGAG——GATATC—

—GAGCTp——CTATAG——(^CGTC——GGG^CC——CpATGG—

XhoVEcoRVPstIS?naI'Kpnl

A.构建重组载体P时，应选择EcoRV或Smal进行酶切，再用T,DNA连接酶连接

B.要使中间载体P接入载体E,同时防止自身环化，可选用Xhol和PstI进行酶切

C.载体P不能作为基因表达载体，因为它不含起始密码子和终止密码子

D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞

8.如图表示利用新冠病毒包膜表面的S蛋白制备疫苗的相关过程，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其表

达产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用，其中m、n分别是启动子和终止子。下表中是

可供选择使用的限制酶及其识别序列和酶切位点。据图表推测，下列叙述错误的是（）

A.过程①所需的酶是逆转录酶和DNA聚合酶

B.过程②所使用的两种限制酶是Sau3A回和Nco0

C.据图推测，目的基因S转录的模板链最可能是b链

D.SUC2可作标记基因，对导入B的酵母菌进行筛选

9.转Bt基因抗虫棉可以有效杀死棉铃虫，其原理是Bt基因表达的产物Bt抗虫蛋白能与棉铃虫肠道上皮细

胞表面的特异性受体结合，使细胞膜穿孔，导致棉铃虫死亡。下列相关叙述错误的是（）

A.转Bt基因抗虫棉的培育利用的原理是基因重组

B.Bt基因在抗虫棉细胞中表达需要经过转录和翻译过程

C.培育转基因抗虫棉时，导入Bt基因的受体细胞不能是棉花的叶肉细胞

D.若棉铃虫肠道上皮细胞表面特异性受体发生改变，可能会影响抗虫效果

10.某科研小组用PCR扩增酵母菌的rRNA基因。PCR包括多个循环，每个循环可以分为变性、退火、延伸

3个步骤。下列叙述正确的是（）

A.设计引物时需知道rRNA基因的部分序列

B.延伸时间取决于酵母菌基因组DNA的长度

C.引物浓度大小不会影响PCR扩增获得酵母菌rRNA基因的数量

D.PCR反应前常对微量离心管进行离心以确保反应液分散于管内

11.利用PBR322质粒将人胰岛素基因导入大肠杆菌（如图1）可进行工业化生产。为检验基因表达载体是

否成功导入，将处理后的大肠杆菌接种在培养基上，长出的四个菌落用无菌纸分别盖印至四种不同的培养

基上（如图2,菌落相对位置不变），菌落生长状况如图所示，则成功导入基因表达载体的菌落是（）

“抗四环素基因

图I

■・2

♦・

无抗生素

的培养基含氨羊青毒含四环素氨苇青霉+四环素的培养基

素的培养基的培养基

图2

A.菌落1、2、3B.菌落1

C.菌落2、3D.菌落4

12.乙肝病毒基因工程疫苗的生产和使用流程如图，质粒中LacZ基因可使细菌能够利用物质X-gal,从而使

菌落呈现蓝色，若无该基因，菌落则呈白色。下列叙述错误的是（）

A.过程①中目的基因和载体重组的效率与载体和目的基因的浓度及比例等有关

B.过程②需要在培养基中加青霉素和X-gal以获得呈蓝色的大肠杆菌菌落

C.大肠杆菌是否成功表达出乙肝病毒外壳，可用抗原一抗体杂交法进行检测

D.该基因工程疫苗不会出现乙肝病毒感染和增殖的情况，安全性高

13.在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于半乳糖昔酶基因（不含终止编码序列）末端，

插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性%半乳糖甘酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素

A链，回答下列问题：

⑴使用限制酶和对质粒和插入DNA片段进行切割。

（2）在转化大肠杆菌前，一般先用处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。

⑶重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是。

⑷将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苇青霉素和X-gal的培养基中培养，若观察到色菌落，可以确定

大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变

的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是o

⑸澳化氟可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用澳化氟在甲硫

氨酸残基C端切割的目的是O

14.科研人员利用图1所示材料构建重组质粒并导入大