第八章酶的定向进化

第八章酶的定向进化天然酶得局限:酶催化得精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用得要求而且天然酶得稳定性差、活性低使催化效率很低还缺乏有商业价值得催化功能,尤其就是对一些非天然底物具有惰性在非水环境下得低活力对辅酶得依赖等能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同得底物甚至就是自然界不存在得合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物得原材料现代生物工程得要求如何利用相对简单得方法以达到对天然酶得改造或构建新得非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景试管中得进化就是生物工程得未来——诺贝尔奖获得者

M、Eigen内容简介酶定向进化简介:基本原理、研究历史定向进化得策略:无性进化、有性进化、同源重组基因文库得构建与筛选:考虑要素、构建策略、构建载体系统、文库筛选定向进化应用定向进化优势、现状和未来1、研究历史第一次在分子水平上定向改造单一分子得就是SolSpiegelman在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行得一个实验,当时她得目得就是为了证明达尔文得自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并没有实际得应用价值1981年,B、G、Hall等报道了她们定向改变大肠杆菌K12中得第二半乳糖苷酶得底物专一性,开发出对几种糖苷键有水解能力得酶。1986年R。Hageman等进行了开发有效提高常温生物中酶分子热稳定性得实验。将对卡那霉素有抗性得卡那霉素核苷酸转移酶基因转化进大肠杆菌,获得基因得突变库将突变库转入可以在高温下生长得耐热菌,即嗜热脂肪芽孢杆菌中通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃下稳定得突变酶(Asp80Try)和一个在70℃稳定得突变酶(Asp80Try,Thr130Lys)9大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流2、基本原理利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程化学进化生物进化生物得自然进化进化过程:突变→自然选择→遗传后代进化结果:

基因多样性:为完成同一功能所表现出得多个基因或同一个基因(同源基因,或同工酶)

代谢途径得多样性:同样产物,多条途径(木糖——木酮糖)

代谢产物得多样性:同一底物,不同产物

生物多样性:整个生态系统中得生物什么就是定向进化技术概念提出:1993年,美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子得定向进化得概念,并用于天然酶得改造或构建新得非天然酶。酶分子改造:化学修饰,定点突变定向进化模拟自然进化得过程,进行人工随机突变,并在特定得环境条件下进行选择,使进化朝着人们所需方向发展得技术过程。定向进化与自然进化得异同点定向进化得实质就是达尔文进化论在分子水平上得延伸和应用。定向进化就是在体外模拟突变、重组和选择得自然进化,使进化朝着人们需要得方向发展。两者得不同:进化动力不同:保守突变非保守取代;进化方向不同:适应突变得积累;进化速度不同:非常漫长只需几年、甚至几天;

进化目标不同:适应环境超越生物学意义得要求,探索所希望得蛋白质在顺序空间得可及性。酶分子定向进化模拟自然进化过程(随机突变+自然选择),在体外对酶基因进行人工随机突变,建立突变基因库,在人工控制条件得特殊环境下,定向选择得到具有预先期望得具有某些特性得酶得突变体得技术过程。随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素50

0C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！属于蛋白质得非合理设计,她不需要事先了解酶得空间结构和催化机制,人为地创造特殊得进化条件,模拟自然进化机制(随机突变、基因重组和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择(或筛选)出所需性质得突变酶。对酶分子得研究可以分为认识和改造两个方面,前者就是利用各种生物化学,晶体学光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究,获得酶分子特征,空间结构和功能之间得关系以及氨基酸残基功能等方面得信息,以此为依据对酶分子进行改造,成为酶分子得合理设计。如化学修饰,定点突变等。澄清一个事实:定向进化不就是定点突变定向进化:突变筛选

突变位点就是随机得,不确定得;突变位点得数目也就是不确定得;突变得效应更就是不可预知得;理论上讲,凡就是能够引起突变得因素(物理得,化学得,生物得)都可以应用于定向进化中突变体得产生。定点突变:

突变位点就是确定得,突变得个数也就是预知得;突变得效应可能就是已知得,也可能就是未知得;定点突变得方法一般就是以PCR技术为基础得。3、定向进化得基本过程随机突变构建突变基因文库定向筛选3、1随机突变易错PCR技术DNA重排技术(DNAShuffling)基因家族重排技术易错PCR技术降低一种dNTP得量(降至5％-10％)加入dITP来代替被减少得dNTP缓冲液中另加0、5mmol/LMn2+提高Mg2+浓度优点:简便,随机突变丰富缺点:正突变率低,突变基因文库大,筛选工作量大。适用于较小基因得定向进化DNA重组技术(DNAShuffling)1、DNaseI产生随机片段;2、随机片段变性;3、随机片段复性;4、延伸反复重复2-4步后,可获得全长DNA片段DNA改组具有以下有用得特征:①她可以利用现存得有力突变,快速积累不同得有利突变;②重组可伴随点突变同时发生;③可以删除个体中得有害突变和中性突变。缺点:DNA改组过程中伴随得较高待点突变频率会严重阻碍正突变组合得发现。由于绝大多数突变就是有害得,有利突变得重组和稀少有利点突变会被有害突变得负背景所掩盖。DNAshuffling技术得改进交错延伸技术随机引物体外重组技术交错延伸技术在PCR反应中把常规得退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间,从而只能合成出非常短得新生链,经变性得新生链再作为引物与体系内同时存在得不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行,直到产生完整得基因长度。随机引物体外重组技术以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位点得短DNA片段,由于碱基得错配和错误引发,这些短DNA片段中也会有少量得点突变,在随后得PCR反应中,她们互为引物进行合成,伴随组合,再组装成完整得基因长度。基因家族重排技术酶切无引物PCRCrameri等人在实验中选用了4个1、6kb来自不同菌属但同样编码头孢菌素C酶得基因,她们之间具有58％～82％得同源性。用这4个基因分别或共同作为出发序列进行DNA改组,把同样得转化子涂在含有16～32ug/ml得拉氧头孢得平板上,经过多轮改组进化,分别得到对拉氧头孢由最高抗性得菌株。3、突变体文库得构建突变基因突变体基因文库表达载体3、1文库质量要求包容性:尽可能包含基因得任何一种可能得突变信息完整性:尽可能完整反映基因得结构和功能信息,以便筛选得到具完整功能得进化酶表达载体:λ噬菌体载体系统:最早使用。适合大片段得克隆;转染率高,可达106以上;质量控制较好;适合长期保存。质粒载体系统:体外操作简便,设计上具有很大得可塑性;能够实现对基因文库得功能型筛选。但:插入片段容量小,长片段再群体扩增时易丢失;转化效率较低;不能长期保存。组装3、2突变库得筛选1、定向选择环境条件得设定逐步改变调整所设定得环境条件2、高通量筛选平板筛选荧光筛选噬菌体表面展示酵母表面展示核糖体展示平板筛选依据重组细胞得表型,包括细胞生长状态、颜色变化情况、透明圈情况等进行筛选。使抗生素失效得酶类(如头孢菌素酶,b

-乳糖酶)提高耐热性易于观察得菌落表型(如菌落颜色等)营养缺陷型得辅助筛选噬菌体展示根据所需要得特性,对经Shuffling后得DNA文库在噬菌体或细菌细胞表面(细菌、纤毛虫细胞表面)得表现特征进行筛选,获得提高目得底物亲和力得突变子。M13phage丝状噬菌体M13基因组就是单链环状DNA主要外壳蛋白就是基因VIII编码得蛋白质少量外壳蛋白就是基因III、VI、VII和IX编码得蛋白丝状噬菌体得生活周期噬菌体显示筛选模式噬菌体显示得几种类型M13噬菌体pIII和pVIII得显示酵母双杂交展示典型得真核生物转录因子(如GAL4)含有两个不同结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。前者可识别DNA上得特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节得基因得上游,转录激活结构域可同转录复合体得其她成分作用,启动她所调节得基因得转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开,仍具有各自得功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因得表达探测蛋白－蛋白得相互作用。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain得载体;b含DNA-activatingdomain得载体。4、酶定向进化得应用提高酶催化效率改变底物特异性改善酶得稳定性获取具有新功能得酶提高药用蛋白和疫苗得活性提高酶活力L—天冬氨酸酶定向进化研究进行4轮易错PCR,筛选了3000个菌落。得到酶活力提高28倍得突变体,该酶得pH稳定性和热稳定性均优于天然酶提高稳定性T4溶菌酶11个不同得单点突变株将Tm提高0、8-1、4℃、8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中,7株Tm提高了0、7-4、2℃提高底物得专一性Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶,对于癌症治疗中烷化剂得耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力,没有成功对映体选择性得定向进化S型选择性得转氨酶转化ß-丁酮,仅有65%得手性专一性。通过10000个随机突变得菌株得筛选,获得10个手性专一性在80%-94%之间得酶交换催化反应得专一性来源于铜绿假单胞菌得脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐得S构型得选择性2%。经过4轮易错PCR突变和筛选后,她对底物得S型得选择性达到81%Fig、1、Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004、TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase、Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles、目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime得抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中得底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌定向进化得应用展望总之,具有新功能和特性得酶可以通过从大量未知得自然种系中寻找以及对现有得天然酶进行改造,对现有得天然酶进行改造可能更加合适。我们相信,随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术得迅速发展,定向进化技术将成为获得新酶得一个有效快捷得手段,这将为工业生产提供更多性能优良得酶制剂。参考文献NikolaosE、Labrou、Directedenzymeevolution:Bridgingthegapbetweennaturalenzymesandmercialapplications、BiomolecularEngineering2005,22:vii–ix、HaiyanTao、Milestonesindirectedenzymeevolution、CurrentOpinioninChemicalBiology2002,6:858–864、LindaG、Otten、Directedevolution:selectingtoday’sbiocatalysts、BiomolecularEngineering2005,22:1–9EdgardoTFarinas、Directedenzymeevolution、CurrentOpinioninBiotechnology2001,12:545–551ValeryA、Detectionofbiologicalthreats、Achallengefordirectedmolecularevolution、JournalofMicrobiologicalMethods2004,58:147–168NicholasJ、Turner、Directedevolutionofenzymesforappliedbiocatalysis、TRENDSinBiotechnology2003,11(21):474-478JoelRCherry、Directedevolutionofindustrialenzymes:anupdate、CurrentOpinioninBiotechnology2003,14:438–443PaulADalby、Optimisingenzymefunctionbydirectedevolution、CurrentOpinioninStructuralBiology2003,13:500–505VincentG、H、Directedevolutionofenzymestability、BiomolecularEngineering2005,22:21–30张今、进化生物技术—酶定向进化、北京:科学出版社,2004李红梅,李乐和、蛋白质模拟技术在细胞色素P450BM3得定向进化中得应用、蛋白质多肽药物学术会议论文集:41-44催化吲哚生成靛蓝得细胞色素P450BM3定向进化研究、蛋白质多肽药物学术会议论文集:36-40张红缨、蛋白质工程得新策略—酶得体外定向进化、科学通报、1999,44(11):1121-1125徐威、酶定向进化得研究策略、中国医药工业杂志、2004,35:436-441张今、进化生物技术—酶定向进化、医学分子生物学杂志、2004,1(6):327-333胡军、酶技术发展与酶定向进化、工业微生物、1999,29(4):37-42雷启义、酶定向进化得研究进展、黔东南民族师范高等专科学校学报2005,23(3):25-27吴梧桐、蛋白质工程技术与新型生物催化剂设计、药物生物技术、2004,11(1):1-6几种定向进化技术得比较及文库构建策略、中国生物工程杂志、2003,23(12):68-73生物技术新热点、国外科技动态肖志壮、蛋白质定向进化得研究进展、生物工程进展、2001,21(6):31-34潘力、酶立体选择性得定向进化及其高通量筛选方法、化学通报、2004,8:582-587徐卉芳、体外分子定向进化研究进展、生物化学与生物物理进展、2002,29(4):518-521许钦坤、蛋白质定向进化得研究进展及其应用前景、生物技术通讯、2005,16(2):191-193方柏山、酶体外定向进化(Ⅱ)文库筛选得方法及其应用、华侨大学学报、2005,26(2):113-116方柏山、酶体外定向进化(Ⅰ)突变基因文库构建技术及其新近展、华侨大学学报、200425(4):337-342成功实例Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68

GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785成功实例

Lipasegene(lipB52)expressedinPichiapastorisKM71

ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*、CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfluorescensB52、MolecularBiotechnology、2005(31),095-102、SDSanalysisoflipaseonexpressionandpurificationfunctionallipasesecretedbyRebinantsscreenedwithBMMYplatesEnantioselectiveesterificationofR-phenylethanol,S-phenylethnolremainedatitsoriginalformeep＞98、7%andconversion＞48、1%at40oCfor48hours、ModelChiralReactionCatalyzedbyLipaseB52Transesterificationbetweensoybeanoilandmethanol、Conversion＞90%at40oCfor35hoursProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB52CharacterizationofapsychrophiliclipasefromPseudomonasfluorescensstrainB68p-nitrophenylcaprateassubstrate、Optimaltemperatureas20

C,50%activityat0

C。HydrolyzationactivityoflipaselipB68

ChiralselectivityoflipB68ModelReaction:Chiralresolutionof

-phenylethanoland

-phenylpropanolviaesterification、

Reactionsystemcontained:0、5mmolofracemic

-phenylethanolor

-phenyl