核酸的生物合成省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

第十章核酸生物合成第一节DNA生物合成

第二节RNA生物合成第1页遗传信息传递中心法则

蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物遗传信息以密码形式储存在DNA分子上，表现为特定核苷酸排列次序。在细胞分裂过程中，经过DNA复制把亲代细胞所含遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞生长发育过程中，这些遗传信息经过转录传递给RNA，再由RNA经过翻译转变成对应蛋白质多肽链上氨基酸排列次序，由蛋白质执行各种各样生物学功效，使后代表现出与亲代相同遗传特征。以后人们又发觉，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己RNA为模板复制出新病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则补充。

中心法则总结了生物体内遗传信息流动规律，揭示遗传分子基础，不但使人们对细胞生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻认识，而且以这方面理论和技术为基础发展了基因工程，给人类生产和生活带来了深刻革命。第2页一、DNA半保留复制（semiconservativereplication）（一）概念1953年Watson和Crick在DNA双螺旋结构基础上提出了DNA半保留复制假说。在复制过程中，双螺旋DNA分子两条多核苷酸链首先碱基间氢键断裂局部解开为单链，然后按碱基配正确方式以每条单链分别作为模板各自合成一条同自己有互补碱基新链，这么形成了与亲代双链DNA遗传信息完全相同两个子代新DNA分子。每个子代DNA分子两条核苷酸链中，一条来自亲代DNA，另一条是新合成。这种复制方式称为半保留复制。第3页DNA半保留复制概念

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶催化下按碱基互补标准合成两条与模板链互补新链，以组成新DNA分子。这么新形成两个DNA分子与亲代DNA分子碱基次序完全一样。因为子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成，这种复制方式称为半保留复制。第4页DNA半保留复制试验依据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标识加密度梯度离心技术试验,证实了DNA是采取半保留方式进行复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA第5页复制中大肠杆菌染色体放射自显影图

(Caims试验)将3H-胸苷标识大肠杆菌DNA，经过近两代时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链组成。已复制部分站整个染色体三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链是标识，另外一股双链（A）两股链都是标识，银粒子密度为前二者两倍。染色体全长约为1100微米。ABC环状DNA复制

ABC第6页（三）DNA半不连续复制1968年ROkazaki提出。DNA在半保留复制过程中产生两条子链，一条链连续合成子链称前导链，另一条不连续合成子链称后随链。两条链合成方向都是5′→3′。实际上半不连续复制学说是半保留复制补充。第7页冈崎片段：DNA半不连续复制时，合成一些短不连续DNA片段称～。原核细胞约含1000-nt；真原核细胞约含100-200nt。第8页（四）原核细胞DNA复制过程-E.coli1.与复制相关酶和蛋白质（1）DNA聚合酶Ⅰ1956年Kornberg等首先从E.coli分离出主要功效：①5′→3′方向聚合作用，需RNA引物，活力低。单链球状蛋白，含锌，每秒可聚合10个碱基。5′→3′方向聚合5个特点。②具3′→5′外切酶（校正）和5′→3′外切酶（切除引物）能力。对DNA损伤进行修复以及在DNA复制过程中填补引物RNA被切除后空隙。第9页（2）DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ1969年PDelucia与JCairns发觉一株大肠杆菌变异株DNA聚合酶Ⅰ活力极低，但能以仍能以正常速度合成DNA。所以，怀疑DNA聚合酶Ⅰ是否在体内负责DNA复制。1970-1971年Kornberg和Gefter先后从大肠杆菌分离出另外两种DNA聚合酶，分别命名为DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ。第10页Ⅱ主要功效：①5′→3′聚合作用，活力低，作用不清楚；②具3′→5′外切酶能力，无5′→3′外切酶能力。Ⅲ主要功效：①5′→3′聚合作用，活力强，起主要作用。②具3′→5′外切酶能力，无5′→3′外切酶能力。第11页（3）DNA连接酶DNA连接酶是指催化一个DNA链5′-磷酸根与另一个DNA链3′-羟基形成磷酸二酯键酶，不过这两条链必需都同—个互补链结合，而且必需是相邻。反应需要供给能量，细菌连接酶以NAD+为能量起源，动物细胞和一些噬菌体以ATP为能量起源。第12页作用特点：①连接缺口；②两条链5′-P和3′-OH相邻；③它们有一共同互补链；④需要能量：细菌，NAD+；动物细胞和一些噬菌体，ATP；主要功效：连接缺口，在DNA复制、修复、重组中均起主要作用。第13页第14页（4）DNA拓扑异构酶

拓扑异构酶主要分为两类：拓扑异构酶I和拓扑异构酶Ⅱ。拓扑异构酶I：主要集中在活性转录区，同转录相关，能够使双链DNA分子中一条链发生断裂和再次连接，反应不需要能量供给；拓扑异构酶Ⅱ：主要分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制相关，能使DNA两条链同时发生断裂和再次连接，需要ATP提供能量，它们之间协同作用控制着DNA拓扑结构改变。第15页（5）DNA解旋酶作用：解开DNA双螺旋，使链间氢键断裂；（6）引发酶或引物酶作用：合成一段RNA引物，识别起始点；（7）单链结合蛋白（SSB）作用：SSB在原核细胞和真核细胞中都有发觉，它能与被解链酶解开DNA单链紧密结合，并维持其单链状态，以利于单链模板作用。第16页（8）引发体蛋白质DNA复制是一个极其复杂过程，引物酶还必须要形成复杂引发体（primosome）后才能引发DNA合成。引发体主要组成部分——引发前体（preprimosome）是由6种蛋白质即dnaB、dnaC、PriA、PriB、PriC和DnaT共同组成。引发前体在单链结合蛋白SSB作用下和模板相结合形成中间体结构，再与RNA引物合成酶（引发酶）相结合，组装成完整引发体。完整引发体能够在模板上沿模板链5′→3′方向进行滑动，移动到一定位置上，依靠dnaB蛋白识别复制起始点，即能够引发RNA引物合成。第17页2.复制过程（1）DNA复制起始①DNA复制起始点和方向首先，引发酶在DNA模板上识别出复制起始点，由此开启引物RNA合成。大肠杆菌只有一个起始点，而真核生物DNA有多个起始点。DNA复制方向能够是单向，也能够是双向。其证据来自放射自显影技术或电子显微镜观察。试验证实，大肠杆菌及大多数生物染色体DNA复制是双向进行，出现“θ”结构。第18页②模板DNA双链分离识别起始点后，在DNA拓扑异构酶、DNA解旋酶及单链结合蛋白作用下，DNA双链松开，能量由ATP提供。其双链松开后形成复制叉。③引物RNA合成DNA双链解开后，以其单链为模板，在引发酶和引发体蛋白质蛋白质共同作用下，合成一段RNA，其合成方向5′→3′。在细菌中RNA引物由50-100个核苷酸组成，哺乳动物则少至10个核苷酸。第19页第20页（2）DNA复制延长RNA引物合成后，按照模板链上3′→5′方向，在DNA聚合酶Ⅲ催化下，以dNTP作为底物，在引物3′-OH端不停掺入对应脱氧核苷酸（每掺入1个核苷酸，从底物dNTP上切下一个焦磷酸），新链不间断地延长。①前导链连续复制在引物、底物及DNA聚合酶Ⅲ作用下，以3′→5′DNA单链为模板，按5′→3′方向连续合成新DNA链。第21页第22页②后随链不连续复制新3′→5′链是不连续合成。先按5′→3′方向（与复制叉移动方向相反），在引物、底物及DNA聚合酶Ⅲ作用下合成若干冈崎片段。然后经过DNA聚合酶I5′→3′外切酶活性将RNA引物上核苷酸单位逐一除去。每个核苷酸单位被切除后马上被与模板链对应位置碱基互补脱氧核苷酸补上。是利用前面冈崎片段作为引物经过DNA聚合酶I聚合酶活性完成。最终，DNA连接酶经过磷酸二酯键将2个片段连接起来，并封闭缺口，使其成为完整滞后链。第23页③DNA聚合酶“校对”作用DNA聚合酶3′→5′外切酶活性是校对新生DNA链和更正聚合酶活性所造成“错配“一个于段，当因聚合酶活性作用插入一个错配核苷酸时，酶能识别这种“失误“并马上从新DNA链3′端除掉所错配核苷酸。然后再按5′→3′力向和正常复制过程在新生DNA链3′端加上正确核苷酸。所以当复制叉沿模板链移动时，所加入每个脱氧核苷酸单位都将受到检验。DNA聚合酶校正功十分有效，其准确率到达每聚合104个核苷酸单位至多出现一个错配核苷酸。第24页（3）DNA复制终止DNA复制终止（termination）随DNA分子形状不一样而有差异。对线性DNA分子来说，当复制叉抵达分子末端时，复制即终止。★环状DNA：复制情况多数为定点、双向、对称、等速方式复制，其复制终点普通距起点180bp左右，两个复制叉在此处相遇，合成即告终止。两个复制叉可能同时抵达一个特定部位，也可能其中一个复制叉先抵达此处停顿，“等候”另一个移动较慢复制叉，先行抵达复制叉不会越过这一特定部位继续复制，这意味着此处有一个特异终止信号。第25页大肠杆菌有6个终止子（terminator）位点，分别称为terA～terF。与ter结合蛋白质称为Tus蛋白（terminusutilizationsubstance））。Tus蛋白可识别并结合于终止位点20bp共有序列，含有反解旋酶（contra-helicase）活性，能阻止DnaB蛋白解旋作用，从而抑制复制叉前进，促使复制终止。Tus-ter复合物只阻止一个方向复制叉前进，即不让对侧复制叉超出终点后过量复制。DNA复制完成后，又可在拓扑导构酶作用下，将DNA分子引入超螺旋结构，进行深入装配。第26页（五）真核细胞DNA复制过程1.与复制相关酶最少有5种：α：细胞核，5′→3′聚合作用（相当于DNA聚合酶Ⅲ），延长后随链，引发酶，有3′→5′外切酶活性。β：细胞核，5′→3′聚合作用，修复δ：细胞核，5′→3′聚合作用，延长前导链，解旋酶作用，有3′→5′外切酶活性。γ：线粒体，线粒体DNA复制ε：细胞核，修复第27页2.复制过程(与原核细胞区分)真核细胞DNA复制基本过程可能十分相同于原核细胞DNA复制。但二者相比，主要有以下不一样之处：（1）过程复杂。起始点多，双向复制；冈崎片段长度比原核短。（2）复制总速度快，但复制叉移动较慢。真核生物复制叉每分钟移动约1～3kbp，而细菌约为50kbp。（3）不能连续发动复制。一个起始点从开始复制起，在全部复制完成之前，该起始点不再重新开始复制，但原核细胞中，起始点能够连续发动复制。（4）与原核细胞DNA聚合酶是有差异。（5）真核细胞DNA比原核细胞DNA大得多，且与组蛋白结合形成染色体。（6）端粒复制—端粒酶。第28页二、DNA损伤修复细胞含有一系列机制，能在一定条件下使DNA损伤得到修复。其中了解最清楚由紫外光照射而引发DNA破坏修复机制。（一）嘧啶二聚体形成紫外光照射能够使DNA链中相邻嘧啶形成一个环形丁烷，主要产生胸腺嘧啶二聚体。二聚体形成使DNA复制和转录功效受到妨碍，因而必须除去。（二）修复机制第29页1.光复活修复光复活机制是可见光激活了光复活酶，使之能分解因为紫外光照射而产生胸腺嘧啶二聚体。光复活酶专一性较高(只作用于因紫外光射而形成胸腺嘧啶二聚体)，它分布很广。从单细胞生物一直到鸟类都有，但在高等哺乳动物中不存在。第30页

嘧啶二聚体紫外光损伤DNA暗修复过程第31页2.切除修复——复制前修复切除修复（excisonrepair）：是在一系列酶作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以切除受损伤部位所对应互补链为模板，重新合成出被切去部分，然后使DNA再恢复正常结构过程。依据切除部位不一样，可分核苷酸切除修复（nucleotideexcisonrepair，NER）和碱基切除修复（baseexcisonrepair，BER）两种类型。参加切除修复酶主要有特异核酸内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶，主要步骤以下：第32页（1）专一内切酶在靠近二聚体处切断单链DNA；（2）DNA聚合酶利用完整互补链为模板，在断口处进行局部修复合成；（3）5′—核酸外切酶切除含嘧啶二聚体寡核苷酸片段；（4）连接酶将新合成DNA链与原来DNA链连接在一起。按上述次序进行修复为“先补后切”，也能够“先切后补”，即（2）和（3）颠倒。这种修复机制也称为切除修复，是比较普遍一个修复机制，对各种损伤均能起修复作用。第33页3.重组修复——复制后修复当DNA发动复制时还未修复损伤部位也能够先复制再修复。比如，含有嘧啶二聚体、烷基化引发交联和其它结构损伤DNA依然能够进行复制，不过复制酶系在损伤部位无法经过碱基配对合成子代DNA链，它就跳过损伤部位，在下一个冈崎片段起始位置或前导链对应位置上重新合成引物和DNA链，结果使子代链在损伤相对应处留下缺口。这种遗传信息有缺损子代DNA分子可经过遗传重组加以填补，即从完整母链上将对应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成序列补上母链空缺，此过程称为重组修复（recombinationrepairing）。因为发生在复制之后，又称为复制后修复（postreplicationrepair）。第34页在这个过程中，需要激活一个关键酶，即由rec

A基因编码RecA蛋白。RecA蛋白结合在子链空缺处，引发对侧正常模板链与子链重组，从而将子链修复成完整子链。模板链上留下空缺由DNA聚合酶I合成DNA片段填补，最终由连接酶连接，使模板链重新成为一条完整DNA链。经过重组过程后，DNA损伤可能仍保留下来，但伴随屡次复制及重组修复，损伤链所占百分比越来越少，不影响细胞正常功效。第35页图16-15重组修复过程X表示DNA链受损伤部位。虚线表示经过复制新合成DNA链。锯齿线表示重组后缺口处再合成DNA链。第36页4.诱导修复与应急反应光复活修复、切除修复、重组修复可不经诱导而发生，但许多能引发DNA损伤或抑制复制处理均能产生一系列复杂诱导反应，称为应急反应。图16-16SOS反应机制第37页三、RNA指导下DNA合成

1970年H.Temin和D.Baltimore同时分别从鸟类劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒中分离出RNA指导DNA聚合酶。这个酶以4种脱氧核苷三磷酸为底物，能生成与病毒RNA(模板)碱基序列互补DNA。因为它催化遗传信息从RNA流向DNA，与转录作用恰好相反。故称为逆转录酶或反转录酶。病毒感染细胞后经过逆转录酶生成与病毒RNA碱基序列互补DNA，并整合到宿主细胞染色体DNA中。RNA→RNA-DNA→dsDNA第38页★逆转录酶是一个多功效酶，它除了含有以RNA为模板DNA聚合酶和以DNA为模板DNA聚合酶活性外，还兼有RNaseH、DNA内切酶、DNA拓扑异构酶、DNA解链酶和tRNA结合酶活性。★逆转录酶不含有3′→5′外切酶活性，所以它不含有校对功效，合成时含有较高错误率，这可能是逆转录瘤病毒较快出现变异新病毒株原因。第39页★逆转录酶发觉主要意义：（1）在理论上，补充和丰富了中心法则。（2）逆转录发觉及其过程研究不但有利于对RNA病毒致癌机制了解，而且能够指导肿瘤防治和药品设计。（3）逆转录酶在基因工程上应用广泛。第40页第二节RNA生物合成第41页第二节RNA生物合成一、DNA指导下RNA合成—转录（一）定义DNA分子中遗传信息转移RNA分子中过程称为转录。转录产物：mRNA、rRNA、tRNA原核细胞mRNA为单顺反子或多顺反子真核细胞mRNA为单顺反子模板链（无义链、反义链）：能转录DNA链称～非模板链（有义链、正义链、编码链）：起调整作用DNA链称～转录：某一条链某一段复制：完整两条链第42页（二）原核细胞转录1.RNA聚合酶

早在1959年，已从细菌、动物和植物中发觉了RNA聚合酶。1960年Weiss和Hurwitz分别从细菌和动物中分离了一个DNA指导下RNA聚合酶（DNA-directedRNApolymerase）。（1）作用①DNA模板②4种NTP为底物及镁离子③聚合作用5′→3′④不需要引物，无校正功效第43页（2）组成

全酶（α2ββ′σω），其中α2ββ′ω称关键酶，具催化活性可使合成RNA链延长。σ因子识别起始点，一旦合成起始，即释放出来；β：起始作用，催化部位；β＇：结合DNA；α：与开启子结合。第44页2.转录过程（1）起始RNA聚合酶首先与模板DNA特定部位即开启子某一部位结合。开启子是指RNA聚合酶能识别、结合和开始转录一段DNA序列。原核细胞开启子约含40-60个bp。开启子区域有三个功效部位：①起始部位②Pribnow框③识别部位。第45页①起始部位：此处有与转录生成RNA链中第一个核苷酸互补碱基对；②Pribnow框：在转录起始上游-10bp处有一富含A-TbpTATAAT序列；③识别部位：其位置在-35bp附近，序列特征为TTGACA，这是RNA聚合酶初始识别部位。第46页（2）延长从起始到延伸转变过程，包含σ因子由缔合向解离转变。DNA分子和酶分子发生构象改变，关键酶与DNA结合松弛，关键酶可沿模板移动，并按模板序列选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长RNA链3′-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向是沿DNA模板链3′→5′方向按碱基配对标准生成5′→3′RNA产物。RNA链延伸时，RNA聚合酶继续解开一段DNA双链（转录泡），长度约17个bp，使模板链暴露出来。新合成RNA链与模板形成RNA-DNA杂交区。伴随聚合反应进行，转录泡前方DNA解旋、解链，转录RNA向3′方向延伸，即与DNA模板链形成8bp长DNA-RNA杂交体也向前方移动；转录泡后方DNA两条单链快速恢复为双链螺旋构象。所以，伴随RNA聚合酶移动，酶和转录泡前方DNA解旋、解链，后方DNA恢复螺旋连续进行，贯通于延长过程一直。第47页（3）终止：当关键酶沿DNA模板3′→5′方向移动到终止信号区域时转录就终止。提供终止信号DNA序列称终止子。转录终止信号：①不依赖ρ因子：回文结构，富含G-C碱基，回文后有寡聚尿苷，形成具茎环发夹形结构。②依赖ρ因子：回文结构，无富含G-C碱基，也无寡聚尿苷。ρ因子参加终止。第48页3.转录后修饰加工①rRNA：30SrRNA前体先在特定碱基处甲基化，然后断裂产生17S和25SrRNA中间产物。中间产物再经过核酸酶作用除去一些核苷酸残基，才生成原核生物特有16S和23SrRNA。5SrRNA是从30SrRNA前体3′端分离。17S→16SrRNA30S→25S→23SrRNA小碎片→5SrRNA第49页②tRNA：其加工包含：a.5′和3′端多出核苷酸除去；b.3′端添加CCAOH序列，由核苷酸基转移酶催化；c.碱基特征性修饰。如甲基化、脱氨和还原作用。③mRNA：在原核生物中转录翻译相随进行，多基因mRNA生成后，绝大部分直接作为模板去翻译各个基因所编码蛋白质，不再需要加工。第50页（三）真核细胞转录1.RNA聚合酶Ⅰ：核仁，合成rRNA(5.8S、18S、28S)Ⅱ：核质，合成mRNAⅢ：核质，合成tRNA和5SRNA2.转录过程（略）3.转录后修饰加工

第51页①rRNA：在真核细胞中rRNA转录后加工与原核细胞类似，但更为复杂。rRNA在核仁中合成，生成一个更大45S前体rRNA。45SrRNA前体约含14000个核苷酸残基，加工第一步是其中100多个核苷酸残基被甲基化，其中多数残基甲基化部位是其核糖部分2＇-OH。甲基化45SrRNA前体再进行一系列酶促分解后产生真核生物核糖休特有18S、28S和5.8SrRNA。真核生物5SrRNA生成经过另外路径。真核生物5SrRNA生成经过另外路径。第52页②tRNA：由RNA聚合酶Ⅲ转录，加工与原核相同，但3’端CCA都是后加，还有2＇-O-甲基核糖。③mRNA：真核生物编码蛋白质基因以单个基因为转录单位，但有内含子，需切除。信使RNA原初转录产物是分子量很大前体，而且很不均一,称为核内不均一RNA(hnRNA)。其加工过程包含：a.5‘端加帽子（m7Gppp）；b.3‘端加多聚腺苷酸尾；c.mRNA前体剪接。第53页二、RNA指导下RNA合成—RNA复制

一些RNA病毒如f2、MS2、R17和Qβ能以RNA作模板复制出病毒RNA分子，这种RNA指导下RNA合成又称之为RNA复制。三、非编码RNA着重介绍当前非编码RNA领域研究两个热点问题：非编码小分子RNA（microRNA）和RNA干扰（RNA

interference，RNAi）（一）小分子RNA第54页1.MicroRNAMicroRNA是一个大小约21-23个碱基单链小分子RNA，是由含有发夹结构约70-90个碱基大小单链RNA前体经过Dicer酶（RNAaseⅢ家族中对双链RNA含有特异性酶）加工后生成。最早被发觉两个microRNA——lin-4

和

let-7被认为是经过不完全互补结合到目标靶mRNA

3′非编码区端，以一个未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA翻译。第55页2.小分子干扰RNA（siRNA）是另一个小RNA分子，也是由Dicer酶加工而成。能够激发与之互补目标mRNA缄默。（二）RNA干扰（RNAi）1.RNAi概念RNAi是指经过反义RNA与正义RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因转录后表示现象，它经过人为地引入与内源靶基因含有相同序列双链RNA（正义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因mRNA降解,到达阻止基因表示目标。第56页2.RNAi作用机制RNAi作用机制包含转录缄默机制、转录后缄默机制和翻译机制。（1）转录缄默（Transcriptionalgenesilencing，TGS）机制（2）转录后缄默（Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）机制第57页（3）翻译抑制机制RNAi这种作用方式也是作用于转录后形成mRNA，它在调整细胞内基因表示与本身发育方面起着主要作用。首先细胞内源基因转录成原始microRNA，之后在Droslta酶催化下产生microRNA前体（premicroRNA），microRNA前体接下来从细胞核转运至细胞质中，细胞质中microRNA前体再在Dicer酶和ATP共同作用下组装成核糖核蛋白复合体。这个复合体经不完全配对方式与特定mRNA3’非翻译