酶免疫技术和生物素亲和素放大技术

第八章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节酶免疫测定的应用放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标识技术三大经典标识技术

第一节酶免疫技术的特点

重要试剂:酶标识的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性、敏感性原理及特点特点：敏捷度高、特异性强、精确性好酶标识试剂稳定操作简便、无污染易衍生新措施原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

原理及特点标识酶的规定：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和检测措施敏感，反复性好，简朴易行酶的底物易配制保留酶及底物价格低廉对人体无损伤、对环境无污染

一、酶和酶作用底物常用酶酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP）

碱性磷酸酶（AP）β-半乳糖苷酶（β-Gal）

ELISA中应用最为广泛的标识用酶HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。

HRP的常见底物

酶和酶作用底物AP的底物

β-Gal的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸取峰波长为405nm。酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物抗原规定纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

制备措施规定酶标识抗体或抗原制备措施规定技术措施简朴、产率高，反复性好标识反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标识物稳定，不形成聚合物酶标识抗体或抗原制备措施过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标识抗体或抗原戊二醛交联法酶标识抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相似的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标识效率比一步法高，酶标识物质量较均一。酶标识抗体或抗原纯化及鉴定标识完毕后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，防止游离酶增长非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而减少特异性染色强度常用的纯化措施：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标识抗体或抗原固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标识物迅速分离的最常用措施固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面

三、固相载体规定结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充足进行固相措施简便易行，迅速经济种类塑料制品

微颗粒膜载体

固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭

第二节酶免疫技术分类

酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其他标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标识物与对应的抗原或抗体结合后，标识酶的活性会发生变化，不用分离结合和游离酶标识物，通过测定标识酶的活性的变化，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫测定EMIT示意图CEDIA示意图分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不一样之处需分离游离与结合的酶标识物二、非均相酶免疫测定

第三节酶联免疫吸附试验

原理一、基本原理将抗原或抗体固化，加入待检样本和酶标识的抗体或抗原一起反应，洗掉未结合的物质，加入底物显色，检测待检物质的含量。底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体

酶标识物（酶结合物）酶反应的底物

三个必要试剂（试剂盒的重要成分）二、措施类型及反应原理双抗体夹心法措施：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的措施1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY竞争法

措施：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一种抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的措施洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE间接法措施用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。长处一种酶标抗抗体检测多种与抗原对应的抗体应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的措施1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作环节：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的措施竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒关键抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的措施竞争法检测HBeAb:在微孔上预先包被HBeAb（第一抗体），以HRP-HBeAb为第二抗体，中和抗原（HBeAg）起到桥接作用，形成双抗体夹抗原复合物，最终显色。假如待检样本中具有HBeAb，则与HRP-HBeAb竞争结合中和抗原，制止HRP-HBeAb形成复合物，最终不显色。因此，竞争法检测HBeAb时，显色为阴性，不显色为阳性。竞争法测抗原+-YYYYYYEYYYYYYEYEYE中和抗原桥接结合酶标抗体加酶作用底物显色加酶作用不显色或显色弱包被已知抗体待测抗体与酶标抗体竞争结合中和抗原YEYYYEEYYYYYYYEYYYYYYEYYE包被已知抗体竞争法检测HBcAb:在微孔上预先包被HBcAg，HRP-HBcAb可以与HBcAg结合，形成抗体抗原复合物而显色。假如待检样本中具有HBcAb，则与HRP-HBcAb竞争结合包被的HBcAg，克制HRP-HBcAb与HBcAg的结合，最终不显色。因此，竞争克制法检测HBcAb时，显色为阴性，不显色为阳性。竞争法测抗体+YYYYYEY加酶作用的底物不显色或显色弱已知抗原包被YEYE待检抗体与酶标抗体竞争结合包被抗原-EYYEYEYEYE加酶作用的底物显色YE已知抗原包被无待检抗体与酶标抗体竞争捕捉法应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒关键HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的措施捕捉法原理：抗人IgMμ链抗体包被捕捉待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标识特异性抗原的抗体底物显色洗涤洗涤洗涤洗涤捕捉法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色

第四节

酶免疫测定的应用

均相酶免疫测定重要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA广泛用于传染病的诊断，肝炎系列、HIV、TP等。多种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物测定。1．酶免疫技术的重要特点？2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？4．对酶免疫技术的应用评价怎样？5.假如需要检测样本中的抗原，你可以选择哪些类型ELISA措施进行检测？检测原理分别是什么？思索题酶免疫技术是标识免疫技术的一种，它是以酶标识的抗原或抗体作为重要试剂的免疫检测措施，在抗原与抗体的特异性反应完毕后，通过酶对底物的作用深入提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后与否需要分离结合与游离的酶标识物而分为均相和非均相两种类型。均相酶免疫测定重要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据与否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕捉法等。小结第十章

生物素-亲合素放大技术维生素H动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高MW244.31kD.I环为咪唑酮环，可与亲合素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一构造I咪唑酮环

Ⅱ噻吩环

羧基第一节生物素理化性质与标识一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带多种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)生物素活化活化生物素易与抗原、抗体酶及核酸分子中对应基团偶联形成生物素化标识物标识蛋白质氨基的活化生物素标识蛋白质醛基的活化生物素标识蛋白质巯基的活化生物素标识核酸的活化生物素活化生物素标识蛋白质氨基的活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键BNHS合用标识抗体和中性或偏碱性的蛋白质生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）怎样减小空间位阻？长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离标识蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物重要用于标识偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标识氨基标识蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素标识核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成核酸探针，用于DNA或RNA的标识。生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP的构造类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ可直接标识核酸，但对碱基配对有影响。活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一种蛋白分子可被多种生物素标识－多价性；对BNHS多标识抗体,BHZ则多标识微酸性抗原；抗原、抗体标识后活性不变；可对标识材料（如酶）标识：碱性磷酸酶标识后活性将减少；二、生物素标识蛋白质选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标识基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素与蛋白质的比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度0.5~5μg/ml;生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标识亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。并且，两者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标识的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。构造四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI10.56结合位色氨酸色氨酸生物素44亲和力10151015活性13～1515～18亲合素（A）链霉亲合素(SA)一、理化特性二、亲合素/链霉亲合素标识标识物：酶、胶体金异硫氰酸荧光素（FITC）HRP-AV(SA)过碘酸钠、戊二醛ABC/SABC预制AV(SAV)-Biotin第三节生物素-亲合素系统的特点一、敏捷度二、特异性三、稳定性四、合用性五、其他第四节生物素-亲合素系统的应用生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其有关技术被广泛应用在多种标识免疫分析技术领域中，尤其为标识免疫检测自动化分析做出了极大的奉献。一、生物素-亲合素系统基本类型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特点：以游离A分别连接B-Ab和B-EBA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特点：以A-E/SA-E替代BAB法中的A，省却了加B-E的环节3.

ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC二、生物素-亲合素系统