DB51∕T 1175-2010 饲料中苯乙醇胺A的测定高效液相色谱法

DB51/T1175—2010饲料中苯乙醇胺A的测定高效液相色谱法DeterminationofphenylethanolamineAinfeedsI前言 1范围 1 13定义 14原理 15试剂和材料 16仪器和设备 2 28操作方法 29结果计算 310重复性 4附录A(资料性附录)色谱图 5本标准的附录A为资料性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省饲料工作总站负责起草。本标准起草人：柏凡、李云、赵立军、张静、林顺全。1饲料中苯乙醇胺A的测定高效液相色谱法本标准规定了饲料中苯乙醇胺A含量的高效液相色谱法检测方法。本标准适用于配合饲料、预混合饲料和浓缩饲料中苯乙醇胺A的测定。方法最低定量限为2.0mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008,ISO3696:1987,MOD)GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义下列定义适用于本标准。3.1苯乙醇胺A2-(4-(nitrophenyl)butan-2-ylamino)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol苯乙醇胺A,俗称克伦巴胺，分子量：344.17分子式Ci₉H₂₄N₂O₄,2-[4-(4-硝基苯基)丁基-2-基氨基]-1-甲氧基苯乙醇，英文名称为2-(4-(nitrophenyl)butan-2-ylamino)-1-(4-methoxypheny1)4原理样品中的苯乙醇胺A以盐酸甲醇溶液提取，提取液经固相萃取柱净化，用高效液相色谱法进行测定，外标法定量。5试剂和材料除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682中一级水的规定。25.4苯乙醇胺A对照品：纯度≥95%。5.5混合型阳离子固相萃取柱(60mg/3mL),或性能相当者。5.60.1%甲酸溶液：取甲酸1.0mL加水定容至1000mL,摇匀，即得。5.7盐酸-甲醇溶液：取0.1moL/L盐酸80mL,加入甲醇(5.2)20mL,摇匀，即得。5.8稀释液：20%乙腈水溶液。5.9氨化甲醇溶液：取氨水5mL,加入甲醇(5.2)至100mL,混匀。5.10饱和醋酸铅溶液：在50mL水中加入一定量的醋酸铅，超声5min,直至固体不再溶解。5.11标准储备溶液：100μg/mL,准确称取苯乙醇胺A,用甲醇配制成100μg/mL的标准贮备液，-18℃避光保存备用，有效期为三个月。5.12标准工作溶液：根据需要，临用时用稀释液(5.8)稀释标准储备溶液(5.11),配制成浓度范6.1实验室用样品粉碎机。6.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。6.3离心机：可达5000r/min(相对离心力为2988g)。6.5高效液相色谱仪：配紫外检测器。3称取试样2g(精确到0.001g),置于50mL离心管中，准确加入盐酸甲醇溶液(5.7)19mL和1mL饱和醋酸铅溶液(5.10),充分摇动30s,充分振荡20min,然后于离心机上5000r/min离心10min,上清液备用。8.2试样净化固相萃取柱(5.5)分别用3mL甲醇和3mL水活化，准确移取5mL上清液(8.1)过柱，分别用2mL水、2mL50%甲醇水溶液淋洗，近干后用5mL氨化甲醇(5.9)溶液洗脱，收集洗脱液。在50℃水浴中氮气吹干，准确加入1.0mL稀释液(5.8)溶解，过0.45μm微孔滤膜，供高效液相色谱测定。当分析物浓度不在线性范围内时，应将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。8.2.1液相色谱参考条件柱温：30℃;流动相：0.1%甲酸溶液：乙腈，梯度洗脱，梯度见表1;检测波长：276nm表1梯度洗脱条件时间(min)0.1%甲酸溶液(%)乙腈(%)28.2.2定量测定按照上述液相色谱条件测定样品和标准工作溶液，以色谱峰面积进行单点或多点校正定量，样品溶液中待测物的响应值应在仪器测定的线性范围内。9结果计算9.1.1饲料中苯乙醇胺A的含量X,以毫克每千克(mg/kg)表示，单点校正按公式(1)计算：Pi——试样溶液峰面积值；Cs——标准溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);Vs——标准溶液进样体积，单位为微升(μL);Ps——标准溶液峰面积值；4m——称取饲料的质量，单位为克(g);Vi——试样溶液进样体积，单位为微升(μL);n——稀释倍数。多点校正按公式(2)计算：……式中：Cx——标准曲线上查得的试样中苯乙醇胺A的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);m——称取饲料的质量，单位为克(g);n——稀释倍数。9.1.