TSDHCST 001-2024 产前荧光原位杂交实验操作技术规范

ICS07.080CCSA40团 体 标 准T/SDHCST001—2024产前荧光原位杂交实验操作技术规范TechnicalSpecificationforPrenatalFluorescenceinsituhybridization2024年6月12日布 2024年7月10实施T/SDHCST001—2024T/SDHCST001—2024ⅠⅠ目录TOC\o"1-1"\h\z\u前 言 2范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1符号和缩略语 2检测时间与用量 2荧光原位杂交产前诊断对象 2羊膜穿刺术前准备 3样本采集与处理 3仪器与试剂准备 4操作步骤 5室内质量控制标准 9T/SDHCST001—2024T/SDHCST001—2024ⅡⅡ前 言本标准依照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化标准的结构和起草规则》的规定起草。本标准由山东省保健科技协会提出并归口。本标准为首次发布。T/SDHCST001—2024T/SDHCST001—2024PAGEPAGE1产前荧光原位杂交实验操作技术规范范围本标准规定了产前荧光原位杂交技术(FISH)的检测时间、检测疾病、检测对象、检测流程、检测报告、资料和标本的管理和质量控制。131821XY目异常孕妇进行染色体非整倍性的快速辅助诊断。规范性引用文件件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB19489实验室生物安全通用要求；GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法；《荧光原位杂交技术在产前诊断中的专家共识》；《医疗废物管理条例》。术语和定义下列术语和定义适用于本文本。羊膜穿刺术（Amniocentesis）16～24羊膜穿刺时，不易刺伤胎儿。荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）具有安全快速、敏感高效、探针可长期保存、能同时显示多种颜色等优点。符号和缩略语FISH：荧光原位杂交；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PBS：磷酸缓冲盐溶液检测时间与用量16-248-10mL。羊水16180200m2030mL左右的羊水也较为安全，是中孕期羊膜腔穿刺的最佳时机。荧光原位杂交产前诊断对象羊膜穿刺术指征预产期年龄≥35产前筛查（NIPT）高风险者；夫妇一方为染色体异常或遗传性疾病携带者；曾生育过染色体异常或单基因病的患儿；超声发现胎儿结构异常；其他需要抽取羊水检查的情况。羊膜穿刺术禁忌症先兆流产；术前两次测量体温（腋温）37.2℃；（3）有出血倾向（血小板≦70×109/L）；有盆腔或宫腔感染征象；无医疗指征的胎儿性别鉴定等。羊膜穿刺术前准备术前告知签署知情同意书认真核对适应症及有无禁忌症；情同意书。完善相关术前检查（1）血分析、尿分析、凝血四项、传染病八项、ABO血型、Rh血型等；（2）B超检查了解情况以及胎盘附着情况。样本采集与处理标本的采集门诊标本由拥有产前诊断资格的医师采集，抽出的羊水注入无菌离心管内（本操作在酒精灯火焰附近进行B5mL2mL20mL，22-3min，2h。380无标本外泄发生。床科室或相关人员联系核实。标本接收人须检查标本状态。本不合乎要求，须在记录本上记录拒收原因标本的保存处理前的标本保存新鲜羊水离心储存置4℃过夜备用。报告发出后的标本保存：a）1.5mLb）载玻片可于-20℃1仪器与试剂准备仪器移液器（sartorius）、数显恒温三用水浴箱（江苏金域国胜实验仪器厂）、通风柜（山东-豪迈）、离心机（江苏金域国胜实验仪器厂）、电热恒温培养箱（。试剂甲醇（国药，AR）、冰醋酸（国药，AR）、75%及无水乙醇（国药）纯水、生理盐水、产前染色体数目检测试剂盒（安必平）。产前染色体数目检测试剂盒检测位点如下：可检测疾病目标染色体检测区域T21（唐氏综合征）21号染色体21q22.13T18（爱德华氏综合征）18号染色体18p11.1-q11.1T13（帕陶氏综合征）13号染色体13q14.2性染色体数目异常疾病X染色体Xp11.1-q11.1Y染色体Yp11.1-q11.1操作步骤制片低渗（1800r106mL37℃KCl轻轻吹打细胞，37℃32min，8min14固定固定液需新鲜配制，固定液比例为甲醇：乙酸=3:1。2mL1min6mL10min（2）。滴片FISH1.5mLFISH20μL1.5mL老化玻片将滴片后的载玻片至于56℃烤箱中烤片0.5～1h。预处理纯水+400μL1MHCL37℃100μL10%的胃蛋白酶。371*PBS5min。3710min。1*PBS3min。1%多聚甲醛/PBS10min。1*PBS3min。70%90%100%2min。取出玻片，室温晾干。变性封片2-8℃冰箱中取出杂交液，3710min后，震荡均匀。10μL13/21杂交液、18/XY区域，立刻加盖盖玻片，然后用橡皮胶封片。825min。杂交37（452-4h）。杂交后洗涤I72℃水浴锅中提前预热。将杂交后的载玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片（II72℃I中）。72℃I5min。II2min。70%、90%、100%2min。取出载玻片，室温晾干。复染10μLPI10min后即可观察。镜检相关荧光需用合适的滤块观察；其中，13/21杂交液区染色体探针分别显示/绿色（G）/红色（R）信号针分别显示为绿色。10X100X信号并计数；对信号和背景有明确的概念；信号点应位于细胞核内；当细胞核外存在荧从左上到右下的折线方式连续观察；只计数每种颜色荧光信号点≥1注意跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数；结果判读:双人独立阅片，高级职称检验者审核，每个标本随机计数50个细胞核：（1）13/21号染色体判读：绿色（G）/红色（R）显示2个荧光信号时为正常；若绿色（G）/红色（R）显示3个荧光信号时则为13/21号三体型。（2）18/X/Y染色体判读：18号染色体判读：青色（A）显示2个荧光信号时为正常，显示3个荧光信18性染色体判读：女性：绿色（G）2个荧光信号时为正常（46,XX）；若绿色（G）3X染色体三体型（47,XXX）；若绿色（G）1X染色体单体型（45,X）。男性：绿色（G）/红色（R）1（46,XY）；若绿色（G）显示2个荧光信号,红色（R）显示1个荧光信号时为克氏综合征1个荧光信号,2超雄综合征（47,XYY）.单独判断每种指正：正常细胞比例≥90%，异常细胞的比例≤10%，提示该指标未见异常。当出现嵌合体（10%-60%）100个细胞核，当样本中可被有效分析的细胞核少于50个时，应增加一张样本片继续计数分析，或判断为样本信息不足。实验记录FISH实验质控记录单》；1FISH样本计数单》，做好样本数据记录。室内质量控制标准注意离心力的大小，过大会导致细胞核破裂，导致标本作废。洗脱步骤很关键，增加洗脱时间，升高温度或降低盐溶液浓度可导致信号持标本的湿润，以防载波片干燥后引起非特异性染色。PIDAPI是一种潜在致癌物，使用时注意避免直接皮肤接触。盖玻片下气泡影响探针杂交，一旦发现，应想办法