【源版】NEW第五章-毒理学实验基础

第五章毒理学实验基础

(ExperimentalEssentialsofToxicology)哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心1外推

2主要内容毒理学实验的基本原则和基本目的毒理学实验设计要点实验动物的染毒和处置3第一节毒理学实验的

基本原则和基本目的4一、毒理学毒性评价试验的原则在毒理学试验中，有三个基本的原则:1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人基本假设为：①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重（或体表面积）相关。52.实验动物必须暴露于高剂量

是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。此原则是根据质反应的概念，随剂量或暴露的增加，群体中效应发生率增加。一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应（效应）关系，确定受试化学物引起毒效应及其毒性参数。

6WHY?(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了研究化学品可能产生的毒作用。(2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。为了在少量动物得到有统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高的剂量，以使效应发生的频率足以被检测。73.成年的健康实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择(1)成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作为一般人群的代表性实验模型。幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。(2)毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。

81.对照原则在动物实验中，要求相比较的各组间动物的种类、性别、年龄、体重等尽可能地一致。对照组与实验组同等重要，两组的动物数应相等。

(1)空白对照：又称正常对照(2)标准对照：又称有效对照或阳性对照(3)组间对照：(4)自身对照：科研设计遵循的三原则92.重复原则(1)足够的实验样本数：

(2)实验结果的可重复性：

103.随机原则

为了减少个体差异这种非处理因素的干拢，应于实验前将实验动物依统计学原则进行随机分组，以此达到尽可能降低非处理因素的混杂效应，从而提高每组动物间均衡性的目的。

随机分组方法：①随机数字表法；②计算机软件（如SPSS、SAS、Excel等）方法。11二、毒理学毒性评价试验的基本目的

1.受试物毒作用的表现和性质

在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的、逐项的观察和记录。发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前提。

12Log[Dose]BiologicalResponseNOEL:NoObservableEffectLevelNOAEL:NoObservableAdverseEffectLevelLOEL:LowestObservableEffectLevelLOAEL:LowestObservableAdverseEffectLevelFEL:FrankEffectLevel2.剂量-反应(效应)研究

134.确定损害的可逆性

5.其它毒作用的敏感检测指标和生物学标志毒作用机制研究受试物的毒物动力学和代谢研究中毒的解救措施3.确定毒作用的靶器官

14第二节毒理学实验设计要点15一、体内毒理学实验设计1实验动物的选择2剂量设计3对照设置161.实验动物选择气体、蒸汽对黏膜的刺激作用——猫毒物对皮肤的局部作用——豚鼠或兔过敏性反应——豚鼠

豚鼠>家兔>狗>小鼠>猫呕吐作用——狗或猫，不用兔和豚鼠高血压病理研究——狗、兔、大鼠17实验动物的生活年限及体重选择182.剂量选择剂量-反应（效应）关系——当外源化学物染毒剂量增加时，实验动物的毒性反应（效应）随之而增强剂量-反应（效应）关系的存在是确定外源化学物与有害作用的因果关系的重要依据，也可证明实验结果的可靠性19Log[Dose]BiologicalResponse低剂量组：NOAEL中剂量组：LOAEL高剂量组20高、中、低剂量组一般按等比例计算，剂量间距应为2或10低剂量组一般为高剂量组剂量的1/10~1/20急性毒性实验亚慢性毒性试验的高剂量应该用急性毒性的LD50的某个分数或LD01长期或致癌试验，最高剂量选择为有亚慢性毒性实验确定的最大耐受剂量（MTD）213.毒理学实验常用的对照未处理对照组（空白对照）阴性对照（溶剂对照）阳性对照历史性对照22二、体外毒理学实验设计分类剂量选择对照代谢活化体外实验系统23（一）体外毒理学实验分类1.微生物体外实验：用于外源性化学物诱变性和致癌性的筛选2.哺乳动物体外实验：器官水平：包括器官灌流和脏器切片温育，基本保持器官完整性，常用于代谢研究24细胞水平：包括原代细胞和传代细胞，可用于化学物毒性和致癌性的筛选，也可用于研究化学物的代谢和中毒机制亚细胞及分子水平：应用与中毒机制、毒物引起的亚细胞定位及化学物代谢方面的研究

25（二）受试物剂量选择剂量——培养液中受试物的浓度，mg/ml、μg/ml太高——非特异性细胞反应，假阳性太低——不足以引起生物效应，假阴性根据化学物的理化性质，进行预试先测定LD50

（体外），采用1/5LD50

～1/50LD50之间的4～5个剂量26（三）对照空白对照溶剂/赋形剂对照阳性对照历史性对照（同实验室资料的对比）27（四）代谢活化肝S9：常规应用于体外实验的生物活化系统，由β-萘黄酮和苯巴比妥联合诱导的大鼠肝匀浆9000g离心上清液肝微粒体组分：仅含微粒体，混合功能氧化酶活性高，制备复杂28第三节实验动物的染毒和处置29一、动物和受试物实验前的准备1.实验动物编号与标记——清晰、持久、简便、适用染色耳缘剪口号牌烙印30染色法常用染料：3-5%苦味酸（黄），2%硝酸银（咖啡色）和0.5%中性品红（红色）等规律：先左后右，从上到下大于十——两种颜色小于十——鼠尾简易标号312.实验动物的分组——随机分组法以随机分成三组为例

设有动物15只，随机等分成A、B、C三组。将动物编号后，按上述方法，从随机数字表抄录15个数字，将各数一律以3（分组数）除之，并以余数1、2、3代表A、B、C，结果归入A组的动物6只，归入B组的动物4只，归入C组的动物5只，即：32要使三组的动物数相等，须把原归A组的6只动物中的1只改配到B组去。选取哪一个，仍要用随机法可以随机数字表继续按斜角线抄录一个数字，得60，以6除之，除尽（相当于余数为6），就可以把第六个A（即12号）动物改为B组。调整后各组的动物编号如下：333.受试物的准备应了解受试物的纯度及杂质成分，了解受试物的化学结构和理化性质，特别是其挥发性（熔点/沸点）、溶解性、pH、稳定性（包括受试物在赋形剂中的稳定性）对各个毒理学试验，应该采用同一种、同一批号的受试物受试物在储存期的稳定性34受试物常用剂型——水溶液、油溶液、混悬液对溶剂和助溶剂的要求：1）应该是无毒或实际无毒2）与受试物不起反应，受试物在溶液中应稳定3）对受试物的毒动学和毒效学无显著影响4）无特殊的刺激性和气味35水溶性受试物——溶剂首选水（经口染毒）和等渗盐水（胃肠道外染毒）水不溶性受试物——应溶于或悬浮于适当的有机溶剂，如天然植物油（玉米油和橄榄油等）混悬液——常用赋形剂：0.5%羧甲基纤维素钠或10%阿拉伯树胶36二、实验动物的染毒（一）经口（消化道）染毒：1.喂饲法：将毒物掺入饲料或饮水中供实验动物食入或饮用优点：动物自行食用，符合自然条件缺点：不易精确控制染毒剂量（食物消耗量）毒物应符合条件：能与食物或水均匀混合；不与食物成分发生化学变化；不影响食物的气味，颜色；不影响食物的消化和吸收372.灌胃法：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管或灌胃器注入胃内优点：剂量准确缺点：工作量大，并可能伤及食道或误入气管灌胃前应禁食不禁水，灌胃2-4小时后给食3.咽胶囊法：将一定受试物装入胶囊中，放至犬的舌后部，迫使动物咽下优点：剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物缺点：不易操作，只适用于大动物38（二）呼吸道染毒呈粉尘、气体、蒸汽、气溶胶或烟雾状态存在的毒物，均应通过呼吸道染毒1.静式染毒：在密闭的染毒装置中，加入易挥发的液态受试物或气态受试物，造成一定浓度的含毒空气环境，将实验动物置于其中吸入染毒39优点：设备简单，操作方便缺点：随实验进行氧分压降低（实验动物有限）；受试物浓度也逐渐下降适用于小动物的急性毒理实验，染毒时间一般为2-4小时，要求受试物在10min内蒸发完毕40L-RDJ智能型静态染毒柜412.动式染毒：用机械通风装置连续不断按比例送入毒物和新鲜空气，排除等量的污染空气，造成毒物浓度相对稳定、动态平衡的染毒空气环境，使动物吸入染毒优点：染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度相对稳定缺点：消耗受试物的量大，易于污染环境柜内受试物浓度达平衡后，每天染毒时间应为6h，每周染毒5天42动物染毒柜的模式图A整体暴露B口鼻暴露43全自动动态染毒柜——过去的试验基本上是在没有专业的设施条件下进行的，其试验过程可控性差，试验参数如：用药量、用气量，温、湿度等无法实时获取，试验环境也相对恶劣，有毒有害气体泄漏，严重影响试验人员的身体健康。L-RD全自动动态染毒柜的应用，基本上解决了上述问题44产品名称全自动动态染毒柜产品编号L-RD/0300BL-RD/0600BL-RD/1000B外型尺寸（mm）长100012601500宽100012601500高220022002200供药量25μl/min4.25ml/min连续可控供气量30L/min、40L/min、50L/min三级可调适应溶剂水溶性和油溶性染毒浓度预置按需要实验之前设置好染毒浓度，电脑控制根据预置浓度按比例提供药液和压缩空气染毒时间每次按需要设定剩余时间显示显示本次实验剩余时间（倒计时）延时停机设定一个实验结束后延时关机时间，让毒气彻底排空药液消耗实时计量显示本次实验实时药液流量药液消耗累计计量显示本次实验药量消耗累计药液比重设置药液比重参数预置气体流量实时计量显示本次实验实时气体流量气体流量累积计量显示本次实验实时气体消耗累计温度显示显示内胆温度湿度显示显示内胆湿度清洗内胆配有360度旋转喷淋清洗装置，另备有手动喷枪二级排风系统内抽风保证内胆负压，外抽风保障实验环境人身安全。内外抽风都可由电子调风阀调节风量内胆气压指示

加装了-0.8～+0.8kp压力表，显示内胆压力状态用药量预测用药量预测系统方便备药新增可选模块①

加热温控及内循环搅拌系统。该系统使动式染毒柜完全涵盖静式染毒柜功能。②

氧气检测系统。该系统提供实验过程内胆氧气实时数据。453.气管内注入：用于建立急性中毒模型和尘肺研究（三）经皮肤染毒经皮染毒毒性实验：如经皮急性毒性——大鼠，皮肤癌试验——小鼠皮肤刺激和过敏试验：皮肤刺激实验——兔和豚鼠，皮肤试验——豚鼠被毛的去除：机械法和化学法，24h无损伤方可实验46（四）注射染毒：应用较少，主要用于某些化学物的毒物代谢、毒性作用机制研究以及中毒动物模型的建立应调整受试物的pH（5-8）和渗透压（等渗）包括：腹腔注射、静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等47三、实验动物生物标本采集及处死（一）生物样本的采集1.血样采集剪尾采血：需血量少时可用此方法。将动物固定，显露尾部，将尾尖剪去约5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。事先将鼠尾浸在45℃水中数分钟，使尾部血管充盈，可采到较多的血，如将动物麻醉取血量可更多些。小鼠每次采血约0.1ml，大鼠约0.4ml。为了多次反复取血应尽量从鼠尾末端开始。

48眼眶静脉

术者左手拇指和

示指紧紧夹持固定动物头部，拇指中段轻轻挤压颈部静脉，使球后静脉丛充血，右手持针头或毛细管，针头与动物面部呈45°角，由内眦刺入，感到有阻力时即停止穿刺，略加转动，此时若穿刺部位适当，血即流出。小鼠一次可采血0.2-0.3ml，大鼠一次可采0.5-0.1ml49摘眼球采血：此法常用于鼠类大量采血。左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用无钩弯镊子或弯止血钳迅速摘除眼球，立即将鼠倒置，头朝下，眼眶内很快流出血液。一般只适用于一次采血。大部动物采血后可以存活，可采另一侧眼球取血50几个窍门

1、麻醉不要过深，防止心博减弱。

2、取血前将胡须剪掉，取血时小鼠头向下。摘眼球取血一定要让血液滴下去，不要贴着管口噌，那样很容易溶血，

3、血管钳加持住视神经和血管时，向外牵引10秒钟后再缓慢拉断之。使软组织不致缩回眼眶堵住眼动脉的断端。

4、麻醉后小鼠体温不能低于正常时就开始取血。

5、最后阶段加以肝脏按压，可取更多的血。

6、如果小鼠体重在25毫克左右，取血不足1毫升，可以继续摘除另一只眼球。尚可再获少许血液。51心脏采血：将动物麻醉，使其仰位固定，剪去胸前区毛，消毒皮肤，在左侧第3—4肋间选择心博最强处穿刺，血液借心脏跳动的力量进入注射器。亦可在动物麻醉后，切开动物胸腔，直视心脏内抽血或剪破心脏，直接用注射器、吸管等吸血。

52耳缘静脉采血：本法为兔最常用的采血方法，可多次重复使用。将兔固定，拔去耳缘静脉局部的被毛，消毒，用手指轻弹兔耳，使静脉扩张，用针头刺耳缘静脉末端，血液即流出。从耳外缘的耳根部开始。53股动脉采血：本法为采取犬动脉血常用的方法。在清醒状态下将狗卧位固定于狗解剖台上。伸展后肢向外伸直，暴露腹股沟三角动脉搏动的部位，剪毛、消毒，左手中指、食指探摸股动脉跳动部位，并固定好血管，右手取连有51/2号针头的注射器，针头由动脉跳动处直接刺入血管，若刺入动脉一般可见鲜红血液流入注射器，有时还需微微转动一下针头或上下移动一下针头，方见鲜血流入。抽血毕，迅速拔出针头，用干药棉压迫止血2-3min。

542.尿样采集连续收集尿液的方法：大鼠和小鼠可用代谢笼，下部有粪尿分离器；家兔、猫等较大动物，尿量较多，可在饲养笼底部平铺一层尼龙纱网隔粪，下面加塑料薄膜缝制的倒锥形漏斗，漏斗下口接烧杯收集尿液——适用于半减期长（数小时以上）的受试化学物的毒动学研究55一次尿收集法：对半减期短的受试化学物可在全麻下经尿道或经腹壁插管至膀胱收集尿液，对犬可采用接尿法或导尿法。如需准确定时收集尿液，可采用按摩逼尿法，此法对家兔和猫特别适用563.病理解剖和标本的留取动物解剖应在动物死亡或处死后立即进行，以免引起动物死后组织自溶和腐败，影响检查结果取材恰当与否直接影响实验结果，因此必须选取有代表性的脏器组织，要按实验设计留取标本，作到有主有次，毒作用的主要脏器要多留取，其他脏器可适当少留总之，在标本留取上，宁肯留的多一些，全一些，不能因标本留取失误影响实验结果57标本选取应注意：

1)选取病变与正常组织交界处，若肉眼观察不出明显病变时，则各组动物选取的脏器和部位应一致；2)切取脏器的重要结构部分或全部，尽量保持观察的完整性；

3)标本应保持原有的形态，不应受到器械钳夹和挤压；

4)胃肠标本取材时，应将内容物冲洗干净，以免内容物影响组织的尽早固定，产生自溶58(二)动物的麻醉给动物行手术或避免动物剧烈挣扎——使得出现应激反应，体内酶类等发生变化最佳麻醉状态——意识丧失、痛觉丧失和松弛常用的麻醉药物

短效（30min）：对啮齿类多用乙醚，对大动物可用硫喷妥钠10-25mg/kgi.v.或i.p.59中效（120min）：推荐用塞拉嗪+氯胺酮，对啮齿类5-100mg/kgi.m.，对大动物

2-10mg/kgi.m.长效（长于120min）：常用戊巴比妥钠，对啮齿类35-50mg/kgi.p.，对大动物30mg/kgi.v./i.p.,对大鼠还可用乌拉坦1500mg/kgi.m.60（三）动物的处死——安死术安死术（euthanasia）是指公众认可的、以人道主义的方法处死动物的过程，即达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡安死术应具有保证动物中枢神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用死亡症状——心跳、呼吸停止61推荐的安死术方法常用方法：断髓法、断头法、吸入麻醉后处死、麻醉下急性失血法、空气栓塞法62第四节毒理学实验的统计学基础63一、毒理学实验的统计学要点1.毒理学试验设计的统计学要求应遵循随机、重复及对照三个原则每个观察指标应具有代表性，并且是相互独立的具体涉及剂量水平数目及间隔，每个剂量点的实验单位数，每个实验单位接种及计数的细胞数，对照组的设置642.毒理学试验结果的统计分析由剂量水平和相应观察值组成的二维关系型数据毒理学试验处理组与阴性对照组观察值均数的比较根据实验结果（指标）的变量关系类型是数值变量（计量资料）还是分类变量（计数资料），选用不同的统计分析方法65

IPCS专家组推荐的统计学分析方法数据类别和统计学要求统计学方法1．“有或无”数据：动物间的比较个别组的比较Fisher精确分布检验(不分层的数据)2×2校正的卡方检验(分层或不分层的数据)非均匀性

2×K卡方检验(分层或不分层的数据)与剂量相关的趋势

Armitage检验(分层或不分层的数据)动物内部比较个别组的比较McWemar检验或符号检验非均匀性Cochran检验变量问的相关性Fisher精确分布检验2X2校正的卡方检验662．分级数据：动物间的比较个别组的比较MannWhitneyu检验非均匀性Kruskal—Wallis单向方差检验与剂量相关的趋势非参数趋势检验动物内部的比较个别组的比较Wilcoxon配对符号秩和检验非均匀性Friedman双向方差分析与剂量相关的趋势Page检验变量间的相关性Spearman等级相关系数673．连续数据：动物间的比较个别组的比较

t检验非均匀性单向方差分析与剂量相关的趋势线性回