银杏MYB家族基因克隆及功能验证

银杏MYB家族基因克隆

及功能验证

——试验进度报告汇报人高云鹏一、目录前期实验：对克隆R2R3-MYB目的基因的筛选；银杏叶mRNA的提取及cDNA的合成；近期实验：1、培养银杏愈伤组织、扦插苗等无性系；2、对银杏愈伤组织进行胁迫处理3、用荧光定量PCR检测胁迫处理后R2R3-MYB基因表达量4、R2R3-MYB基因的克隆目的基因的克隆及其原核表达技术路线RNAExtractionVectorTVectorTPCRProductAApET-HEHEHEVRT-PCR转化DE3HE蛋白ITPG诱导大肠杆菌R2R3-MYB目的基因的筛选MYB蛋白的DNA结合结构域集中在氨基端，每个重复区含有3个在空间上规则排列的色氨酸残基，这3个色氨酸残基在折叠形成MYB结构域的疏水核中起重要作用，一般在所有的MYB蛋白中是保守的，但R3的第1色氨酸残基被芳香族氨基酸(如苯丙氨酸)或他疏水氨基酸所代替PLVSSI-FCEIIFFNAAIGRWFMQQISNIDHGCPLLSVIEGRP-AYCCNMRSGPSKFSYKTTEYICLLSLSGSGKLERKRAYKCN-SLFLVCGSRKVVQKQQIRRGLCTELQVLGKY-QKVSQGSF-GSAVMGRAPCCDKNGLRKGPWTPEEDQKLNDYIQRHGHGSWRALPKHAGLLRCGKSCRLRWTNYLRPDVKRGKFSFAEEQTIIQLHGVLGNKWSAIAAQLPGRTDNEIKNYWNTHLKKRLRQMGIDPVTHRPRIDLFDFSNMTRFFAPATLSHMSAHWANARLEALTREYLRLAAWRSAAMIGDQQNGTQADTLIIRSKLGADAFCRPDINAHVTAPHPNNWGQNPEIGTVTCSGSDEQIMLGKHADNSEQFQ-银杏叶mRNA的提取mRNA提取注意事项：1、银杏叶mRNA提取其使用的的所有枪头、离心管都要经过严格的灭mRNA酶的活性。2、银杏叶mRNA提取过程中，样品必须始终在液氮的低温保护中，防止银杏叶mRNA在研磨中快速降解。RT-PCR基本原理：将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。mRNAcDNAPCR产物PCR引物设计的目的：

找到一对合适的核苷酸片段，使其能够有效的扩增模板DNA。引物设计目的和PCR扩增引物常用PCR扩增的体系（25µL）和条件程序：95℃变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸10minddH2O19µL上游引物2µL下游引物2µL模板

2µL2XTaqMasterMix25µL→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物设计的原则1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。2.产物不能形成二级结构；避开产物的二级结构区。自由能△G°≥58.6lkJ/mol。3.引物长度一般在15~30碱基之间。4.G+C含量在40%~60%之间。5.碱基要随机分布。6.引物自身不能有连续4个碱基互补，引物之间不能有连续4个碱基的互补

7.引物5′端可以修饰；引物3′端不可修饰。8.引物3′端要避开密码子的第3位。电泳图目的基因转入大肠杆菌RecombinantDNA

DNAligasevector1目的基因导入细胞的方法氯化钙法：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源DNA的进入。宿主细胞与重组DNA在00C的氯化钙溶液中孵育，快速转入420C造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受态细胞。处理宿主细胞

1低渗溶液＋热休克

E.coli+0.1MCaCl2

competent(E.coli)cells

被转化的宿主细胞Low-osmosismakescellexpanding0-4℃RecombinantDNA+42℃Heatmakescellmoreexpandingandmembranemorepermeable

处于感受态的细菌表面正电荷增加，细胞膜的结构有改变，通透性增强，转化子易于进入细胞。

质粒载体带有氨苄青霉素抗性基因，在宿主细胞内该抗性基因表达出可水解氨苄青霉素的酶，因而宿主细胞可在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长。利用抗生素抗性对重组子筛选对银杏愈伤组织进行胁迫处理

各种胁迫处理对R2R3-MYB基因表达的影响实验设计实验因素和水平ABA（100μM）NaCl（200μM)dehydrationcold（