牛角膜浑浊度和渗透性试验

—牛角膜浑浊度和渗透性试验BovineCornealOpacityandPermeability(BCOP)Assay1范围本方法规定了牛角膜浑浊度和渗透性试验的基本原则、要求和方法。本方法适用于化妆品原料的潜在不可逆眼损伤和无刺激性的评价，适用于单一物质及混合物。2试验目的本试验通过定量测定牛角膜浑浊度和渗透性的变化，以评价化学品原料对眼角膜的不可逆眼损伤程度。3定义3.1眼睛刺激性EyeIrritation眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。3.2不可逆眼损伤IrreversibleEyeDamage眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。3.3角膜的浑浊度CornealOpacity角膜暴露于受试物后通透性改变的程度，角膜浑浊度增加表明角膜受损。3.4角膜的渗透性CornealPermeability测定通过角膜细胞层的荧光素钠染料的量来代表角膜上皮损伤的指标。4试验原理牛角膜浑浊度和渗透性试验是牛角膜接触化妆品原料后，通过测定角膜浑浊度和渗透性的变化来评估化学品原料的眼刺激程度。5试剂和材料5.1培养液MEM培养液MEM培养液（含酚红）5.2Hanks’溶液称取氯化钙140mg、六水合氯化镁100mg、七水合硫酸镁100mg、氯化钾400mg、磷酸二氢钾60mg、碳酸氢钠350mg、氯化钠8g、磷酸氢二钠48mg、葡萄糖1g，加水至1L。临用新配。5.3荧光素钠溶液液体受试物和固体受试物分别选用浓度为4mg/mL和5mg/mL的荧光素钠溶液进行渗透性试验。5.4阳性对照N，N-二甲基甲酰胺作为液体受试物的阳性对照，20%咪唑溶液作为固体受试物的阳性对照。5.5阴性对照物0.9%氯化钠溶液5.6牛眼大于6月龄的牛眼，直径为1.8cm~2.5cm。牛眼放在2℃~4℃的Hanks’溶液中的使用时间为24h内。5.7浑浊度仪及角膜夹持器（见附录A）浑浊度仪是用来测量浑浊度的装置。根据浑浊度仪的光源不同，分为白光光源的浑浊度仪和单色光源的浑浊度仪。不同光源，体外刺激分的计算公式不同。角膜夹持器由前室和后室两部分组成，前后室的内部直径均为1.7cm，深度2.2cm。6试验步骤6.1牛角膜的制备剔除浑浊、有划痕、白斑、新生血管形成的牛眼。取无缺陷的牛眼，沿巩膜边缘2mm~3mm剪取并剥离角膜，角膜内皮层向上，置于Hanks’溶液中。6.2角膜安装角膜内皮层向下对准O型环放置在夹持器的后室上，再将前室盖在角膜上，前后室组合，旋紧。6.3角膜平衡按先后室再前室的顺序，将32℃预热的MEM培养液加满夹持器的前后室，确保没有气泡，将固定好的角膜夹持器垂直放置于32±1℃恒温设备中平衡1h。6.4基准浑浊度的测定角膜平衡后，按先前室再后室的顺序，吸出前后室培养液，重新加入预热的MEM培养液。浑浊度仪测定并记录每个角膜的浑浊度值，作为基准浑浊度。白光光度仪测定浑浊度小于7的角膜、单色光浑浊度仪测定值介于1200lux到1850lux之间的角膜为合格角膜。6.5角膜的分组取基准浑浊度符合要求的牛角膜，每次试验设受试物组、阳性对照组和阴性对照组，每组至少3只角膜。6.6受试物暴露受试物暴露方式有两种，一种针对液体和表面活性剂（固体或液体），另一种针对非表面活性剂固体。液体和表面活性剂以原液给样；半固体、乳霜和蜡通常按液体测试；纯表面活性剂以配制成浓度为10%液体测试。暴露时间为10min。非表面活性剂固体以配制成浓度为20%溶液或混悬液给样，暴露时间为4h。溶剂首选0.9%氯化钠溶液，也可根据受试物的性质选择蒸馏水或其他可证明对测试系统无影响的溶剂。受试物根据物化性质给样方式有两种，一种直接给样法用于非粘性到微粘性的液体化学品，另一种开窗法适用于半粘性和粘性液体化学品以及纯固体。确保测试化学品充分覆盖上皮表面，并在冲洗步骤中充分去除。直接给样：取分组后带有角膜的夹持器，吸去前室液体，加入750µL受试物于前室中，全部加样后，确保样品覆盖整个角膜，角膜内皮层朝下水平放置于32±1℃恒温设备中。开窗给样：用开窗器移除前室的玻璃片，夹持器前室在上，水平放置。用棉球轻轻吸干角膜上残存培养液，取750µL受试物均匀平铺在角膜上，置于32±1℃恒温设备，暴露时间为10min。6.7暴露后浑浊度值测定暴露结束后，吸出前室内的受试物，用MEM(含酚红)培养液将角膜冲洗三次，再用MEM培养液冲洗至无色，再将MEM培养液加入前室，浑浊度仪测定每个角膜的浑浊度。液体受试物测定后，角膜夹持器需垂直置于32±1ºC的恒温设备中再孵育2h，再次更换前后室培养液，测定每个角膜的浑浊度，作为终浑浊度。对于固体受试物，暴露结束冲洗后测定的浑浊度值直接作为终浑浊度，无需后孵育。每只角膜的浑浊度改变值为终浑浊度减去基准浑浊度。计算每组中角膜浑浊度改变值的平均值作为平均浑浊度。浑浊度改变值=终浑浊度-基准浑浊度6.8光密度值测定吸去前室培养液，加入1mL荧光素钠溶液，夹持器前室向上水平放置32±1ºC恒温设备中孵育90min。取后室液体360μL用酶标仪在490nm波长处测定光密度值，计算每组角膜的光密度值的平均值作为平均光密度值。当光密度值超出线性范围时，对测定液进行稀释光密度值=稀释倍数×（稀释后测定液的光密度值-阴性对照光密度值）6.9体外刺激分数计算根据浑浊度仪的光源不同，分别选用下列不同的体外刺激分数计算公式：白光浑浊度仪体外眼刺激得分（IVIS）=平均浑浊度+15×平均光密度值单色光浑浊度仪体外眼刺激分数（LIS）=平均浑浊度（单色光源光度值lux/7）+15×平均光密度值7试验成立条件阴性对照体外刺激分类属于无刺激性，液体受试物阳性对照N，N-二甲基甲酰胺或固体受试物的阳性对照咪唑眼刺激等级分类为I类不可逆眼损伤，则此次试验成立。8结果判定标准表1眼刺激性反应分级体外刺激分眼刺激分类白光光源单色光源IVIS≤3LIS≤30无刺激性3<IVIS≤55LIS>30且lux/7≤145且OD490≤2.5不可单独预测*IVIS>55LIS>30且lux/7≤145且OD490>2.5或者LIS>30且lux/7>145不可逆眼损伤，I类*该分类需结合其他方法进一步判定。9结果解释当出现以下情况时，认为检测结果不确定：（1）3个角膜中的2个与平均值的结果不一致，或（2）3个角膜中的1个与平均值结果不一致，并且白光光源浑浊度仪：得到的IVIS分数>比55临界值大10；单色光源浑浊度仪：浑浊度分为不可逆眼损伤I类（平均Lux/7>145），但3只角膜中的1只Lux/7<130；单色光源浑浊度仪：光密度值分为不可逆眼损伤I类（平均光密度值>2.5），但3只角膜中的1只光密度值<2.0；单色光源浑浊度仪：LIS分数为无刺激性（平均LIS分数≤30），但3只角膜中的1只LIS分数>40；当检测结果不确定时，应重复测试，当第一次检测结果与第二次检测结果相反时，应进行第三次检测，以第三次检测结果为判定标准。本试验结果能预测受试物的不可逆眼损伤和无刺激性，可作为不可逆眼损伤和刺激性的确定性方法中的组合方法之一。附录浑浊度仪和夹持器浑浊度仪浑浊度仪是牛角膜浑浊度和渗透性试验中用来测量透光率的装置。根据浑浊度仪的光源不同，分为白光光源的浑浊度仪和单色光源的浑浊度仪。根据光源的不同，目前市面上浑浊度仪主要有采用卤素灯的OP-KIT浑浊度仪，采用氦氖绿光激光器的LLBO浑浊度仪以及LED白光光源和LED绿色光源的浑浊度仪。任何类型的浑浊度仪都应符合为一系列浑浊度读数提供线性响应，包含预测模型所涉及的不同刺激等级的阈值。其他证明与经过验证仪器具有相似的结果的设备也可以在实验室使用。角膜夹持器BCOP角膜夹持器由惰性材料（如聚丙烯）制成。夹持器由两（前室和后室）两部分组成，前后室由三个不锈钢螺钉固定，位于前后室的外边缘。前后室均有1个圆柱形内腔。每个腔室容积约5mL。两端各有一个玻璃片。浑浊度仪透过玻璃片检测光通过内径的浑浊度。在开窗暴露时，应将前室端的玻璃片用开窗器移除。玻璃窗和腔室间以及后室的O型环用于防止液体泄漏。前后室顶部的两个孔用于加入和移除受试物和培养基。在暴