KTA0002-CN-Annexin V-AbFluor 488 PI双染细胞凋亡检测试剂盒

AnnexinV-AbFluor™488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒Cat:KTA0002 Size:20T/50T/100T AnnexinV-AbFluor™488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 货号：KTA0002 批号：见产品标签 应用实验：适用于细胞的流式细胞术或荧光显微镜检测 荧光激发/发射：AnnexinV-AbFluor™488:Ex/Em=491/517nm,PI:Ex/Em=535/617nm 保质期：-20℃，避光保存12个月原理凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它能从组织中清除不需要的、受损的或衰老的细胞。在正常细胞中，负性磷脂位于细胞膜的内侧，而膜的外表面则被不带电的磷脂（PS）所占据，当细胞进入凋亡状态后，带负电的PS从质膜的内叶向外叶运输，使PS暴露在细胞外环境中。人抗凝血剂AnnexinV是一种35-36kDaCa2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。AnnexinV标记有荧光团或生物素，可通过与外叶PS结合识别凋亡细胞。碘化丙啶（PI）是一种荧光核染料，对活细胞和凋亡细胞不敏感，但对死细胞有红色荧光染色，与细胞内的核酸结合紧密。AnnexinV-AbFluor™488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒为细胞凋亡提供了一种快速简便的检测方法。在提供的结合缓冲液中，用AnnexinV-AbFluor™488和PI染色细胞群后，早期凋亡细胞显示细胞膜绿色荧光，死细胞显示细胞核红色荧光和细胞膜绿色荧光。活细胞几乎没有荧光。此外，针对凋亡检测和结果的非标准化问题，本试剂盒还提供专利的细胞凋亡阳性对照品。检测可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行分析。包装清单试剂盒组分 规格 储存条件 20T 50T 100T AnnexinVBindingBuffer(5×) 2mL 5mL 10mL -20℃AnnexinV-AbFluor™488 100μL 250μL 500μL -20℃，避光保存PropidiumIodide(PI) 40μL 100μL 200μL -20℃，避光保存ApoptosisInducerA 5μL 5μL 10μL -20℃ApoptosisInducerB 5μL 5μL 10μL -20℃自备耗材·离心机、荧光显微镜或流式细胞仪·可调节式移液枪及枪头、去离子水、载玻片·细胞培养孔板试剂准备注意：各组分开盖前，请先低速离心。1×AnnexinVBindingBuffer：临用前配置，用去离子水把AnnexinVBindingBuffer(5×)稀释成1×AnnexinVBindingBuffer；未用完的试剂4℃可保存6个月。AnnexinV-AbFluor™488：即用型；使用前，平衡到室温；未用完的试剂分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。PropidiumIodide(PI)：即用型；使用前，平衡到室温；未用完的试剂分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。ApoptosisInducerA：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。ApoptosisInducerB：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。实验步骤一、细胞凋亡阳性诱导1.对于待诱导凋亡的培养细胞，分别按照与细胞培养液的体积比1:1,000-1:3,000的比例把ApoptosisInducerA或ApoptosisInducerB加入到培养液中（也可将ApoptosisInducerA和ApoptosisInducerB同时加入培养液中）。2.在4、8、12、16或24h后观察细胞凋亡的情况。通常16-24h后，在光学显微镜下可以看到明显的细胞形态的变化，此时可以用于细胞凋亡染色观察（不同细胞可按实际情况调整诱导浓度及诱导时间）。二、AnnexinV-AbFluor™488/PI细胞凋亡检测A.流式细胞仪分析1.通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。2.4℃，300g离心5min收集1-2×105细胞，用冰预冷的PBS洗涤2次。注意：贴壁细胞使用胰酶（不含EDTA）消化后离心收集细胞，消化时间如果过长，易造成细胞膜结构损伤而出现细胞坏死的假阳性，所以需控制胰酶消化时间。3.用500µL1×AnnexinVBindingBuffer重悬细胞。4.每500µL细胞悬液中加入5µLAnnexinV-AbFluor™488和2µLPI，轻柔混匀。5.室温避光孵育15min。6.孵育结束后后置于冰上。染色后30min内通过流式细胞仪分析细胞。使用491nm和535nm激发，517nm（FITC通道）和617nm（PE或PI通道）附近测量荧光。B.荧光显微镜分析1.对于悬浮细胞：1）按照步骤A.1到步骤A.6的流式细胞分析步骤。2）将步骤A.6的细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤镜通过荧光显微镜分析细胞（AnnexinV-AbFluor™488可以使用FITC设置拍照，PI可以使用Cy®3或TexasRed®设置拍照）。2.对于贴壁细胞，按照以下操作步骤：1）细胞接种于爬片或腔室载玻片上，培养细胞。2）通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。3）除去培养基，用预热或者室温的PBS洗涤细胞2次。4）准备工作液：每100µL1×AnnexinVBindingBuffer添加5µLAnnexinV-AbFluor™488和2µLPI，轻柔混匀。5）在细胞中加入适量的工作液（确保工作液完全覆盖细胞），室温避光孵育15min（可以在冰上孵育，以减缓凋亡过程，但孵育时间需延长到至少30min）。6）用1×AnnexinVBindingBuffer洗涤细胞2次。注意：此步不要使用PBS洗涤细胞。7）载玻片上添加一滴1×AnnexinVBindingBuffer，然后将细胞爬片置于玻片上。对于细胞腔室载玻片上的细胞，添加足够的1×AnnexinVBindingBuffer覆盖细胞。注意：也可使用抗荧光淬灭封片剂封片。8）使用适当的滤光片在荧光显微镜下分析细胞。草莓时刻：除了基于细胞膜的变化检测细胞凋亡，细胞核、细胞质、线粒体的变化也能反映细胞凋亡情况。细胞质的变化主要有Caspase（KTA3020，KTA3023）的表达变化；线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件（KTA4001）；TUNEL法是基于细胞核断裂检测细AnnexinV-AbFluor™488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒胞凋亡的经典方法（KTA2010，KTA2011)。扫描右侧二维码，关注Abbkine公众号，了解更多Abbkine产品信息。 结果展示Figure1.Hela细胞用本试剂盒诱导剂诱导经AnnexinV-AbFluor™488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒染色后检测的凋亡效果图。FAQ1．孵育结束后加入，做流式可以不加1×AnnexinVBindingBuffer吗？可以，加入1×AnnexinVBindingBuffer的体积是根据流式细胞仪要求的上样体积来确定，如果细胞孵育悬液的体积足够，可以不加入该Buffer来补齐体积。2．试剂盒阳性对照如何设置？根据说明书用试剂盒内提供的阳性试剂进行阳性诱导实验，如果诱导效果不明显，建议选用其它诱导剂（如喜树碱）进行诱导。3．在加入100μLAnnexinV结合缓冲液后，可不可以等到60min左右再去做下一步呢?因为这个实验是活细胞染色，先染完第一种染料，如果间隔时间太长，细胞活力会受到影响。推荐产品 货号 品名 推荐原因KTA2010 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光） 检测细胞和组织的细胞凋亡KTA2011 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色色荧光） 检测细胞和组织的细胞凋亡KTA4001 线粒体膜电位分析试剂盒（JC-1） 膜电位变化反映细胞凋亡KTA3022 Caspase-3活性分析试剂盒（比色法） Caspase-3活性反映细胞凋亡KTA3026 Caspase-9活性分析