分子生物学研究方法

精品文档精品文档精品文档精品文档精品文档精品文档名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），最后用Westernblot分析目的蛋白质。这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽,可位于多肽序列的任何部分。一般含有4～8个氨基酸,且没有专一性,作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。可分为单一型NLS和双分型NLS。单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAATKKAGQAKKKKLDK）。SUMO（smallubiquitin-relatedmodifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。SUMO化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。问答题什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。特性：=1\*GB3①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。=2\*GB3②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。=3\*GB3③表型的一致性（Uniformity）由于基因型的一致，近交系个体的表型也是相同的，在实验中用较少的近交系动物就可获得具有统计意义的结果。=4\*GB3④对外界因素的敏感性（Sensitivity）由于近交系某些生理功能的稳定性降低，对外界环境因素变化的反应更为敏感，这使近交系更容易被制备成疾病模型动物。供研究使用。=5\*GB3⑤遗传特征的可辨性（Identifiability）每个近交系都有自己的标准遗传概貌，选择适当的遗传监测方法，即可分辨各个近交系。=6\*GB3⑥遗传组成的独特性（Individuality）每个近交系都具有独特的遗传组成和独特的生物学特性。由于这一特点，采用某近交系所作的实验结果往往不直接代表整个种属的反应，而必须在多个近交系作动物实验，以增加其代表性。⑦分布的广泛性（Extensity）同一品系在不同地区不同国家都广泛存在，引种方便并利于研究结果的交流。⑧背景资料的可查性（Accessibility）具有一份完整的研究背景资料，便于实验设计和结果分析。国内外常用近交系小鼠：=1\*GB3①BALB/c系：乳腺癌发病率低，与其他品系相比血压较高，对慢性肺炎敏感，对放射线特别敏感，繁殖期长。=2\*GB3②C57BL系：毛色黑色（隐性），乳腺癌发病率低，对化学致癌剂不敏感，全身照射后淋巴瘤发病率99～100％，干扰素产量高。=3\*GB3③129sv系：毛色agouti棕褐色（显性）=4\*GB3④FVB系：毛色白化=5\*GB3⑤我国培育的小鼠近交系1946年，我国从印度Haggkine研究所引入小鼠，这是当今广泛应用的昆明种小鼠的原种。简述C.elegans作为模式生物被用于研究生命科学的基本问题的优点及其局限性。（10）答：优点：经济以德，便于实验室培养繁殖速度快全身透明，可清楚直观的观察发育过程雌雄同体的生活史类型，可以产生大量的“自交后代”雄性个体可用于杂交（遗传交配）加入甘油作为防冻介质，线虫可长期保存于—8019000个基因，基因冗余少复杂程度低，但具有组织和器官的分化基因组已经完全测序相关信息和资源丰富局限性（不足）：生物化学研究困难至今仍没有线虫相关的可用细胞系特殊组织解剖分析困难什么叫免疫共沉淀。（10）答：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。实验流程为：（1）转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°（2）取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°（3）取10μlproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；（4）将预处理过的10μlproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°（5）免疫沉淀反应后，在4°C以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×（6）SDS,Westernblotting或质谱仪分析。三、简述题1.C-elegans两种转基因技术？该技术可用于解决什么问题？答：两种转基因技术：（1）显微注射法转基因该方法是将外源基因或体外构建的目的基因在显微操作仪下用极细的微吸管直接注射到活细胞中，已经成功的应用于大的青蛙卵、线虫、培养的哺乳动物细胞、哺乳动物胚胎、植物原生质和组织。（2）粒子轰击法转基因（基因枪法）是物理性导入DNA得方法，用包裹DNA的金属小颗粒轰击受体组织,使DNA实现穿壁并被导入众多细胞中,称为“基因枪法”(或微粒轰击技术).包裹着DNA的金属粒加速到一个很高的速度后(通常需要部分真空以减少颗粒的速度损失)穿透受体组织,一般可以穿透2～3层细胞。解决的问题：（1）通过挽救一个突变表型（用野生型复制）来确定一个基因的功能（2）通过目的基因的报告者建立表达模式（3）借助过表达野生型基因或者突变基因来干扰生物过程（4）建立人类疾病的动物模型（5）生产药用蛋白（6）提高动物的抗病性、培育抗病品种（7）提高动物的生产性能3.简述02年诺贝尔奖的研究贡献。（王亚梅）答：２００２年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科学家悉尼·布雷内、美国科学家罗伯特·霍维茨和英国科学家约翰·苏尔斯顿，以表彰他们发现了在器官发育和“程序性细胞死亡”过程中的基因规则。程序性细胞死亡是细胞一种生理性、主动性的“自觉自杀行为”，这些细胞死得有规律，似乎是按编好了的“程序”进行的，犹如秋天片片树叶的凋落，所以这种细胞死亡又称为“细胞凋亡”。这３位获奖者的成果为其他科学家研究“程序性细胞死亡”提供了重要基础，后来科学家又在这一领域取得了一系列新成绩。科学家们发现，控制“程序性细胞死亡”的基因有两类，一类是抑制细胞死亡的，另一类是启动或促进细胞死亡的。两类基因相互作用控制细胞正常死亡。如果能发现所有的调控基因，分析其功能，研究出能发挥或抑制这些基因功能的药物，那么就可加速癌细胞自杀，达到治疗癌症的目的，提高免疫细胞的生命力，达到抵御艾滋病的目的。4.泛素化，哪年哪个领域的诺贝尔奖？蛋白泛素化过程？泛素化过程中E1、E2、E3、A蛋白酶体的作用。答：２００４年诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解。泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程。一些特殊的酶将细胞内的蛋白分类,从中选出靶蛋白分子。泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应:(1)首先在ATP供能的情况下泛素激活酶(E1)催化泛素C末端的甘氨酸(Gly),形成泛素-腺苷酸中间产物,激活泛素，然后激活的泛素被转移至E1酶的Cys残基上。(2)活化的泛素通过转酰基作用进一步转移到泛素结合酶(E2)上,形成E2-泛素巯基酯。随后,E2酶和一些种类不同的泛素连接酶(E3)共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。(3)E2-泛素复合体接下来可以有两种方式与要降解的底物蛋白质结合:一是直接从E2转移给底物蛋白质形成泛素-蛋白质复合体;二是底物蛋白质首先与泛素连接酶(E3)结合,然后底物蛋白质与E2转移的泛素结合。E3酶的外形就像一个夹子,靶蛋白连接在中间的空隙内。酶的左侧结构域决定靶蛋白的特异性识别,右侧结构域定位E2酶以转移泛素分子。最终泛素-蛋白质复合体主要是被一种沉降系数为26S的蛋白酶体所识别降解,少数被溶酶体和小泡内的酶降解。同时由泛素C末端水解酶释放泛素供再循环利用。E1：激活泛素E2：可特意识别泛素，并与泛素结合，同时还具有识别E3的功能。E3：特意识别靶蛋白，并将其传递给蛋白酶体降解。E4：泛素链组装因子，结合泛素并催化E1、E2和E3的组装，对多聚泛素链的延长起重要作用。蛋白酶体：有两个亚基α亚基主要用于底物识别，β亚基主要参与底物降解。为了获得硕士学位，你需要通过生物化学的方法研究两种蛋白的相互作用。请设计实验来获得蛋白复合物的化学计算(法)。（10）答：要对样品进行生物化学研究，首先要进行样品结晶获得晶体晶体形成原理：形成规律——使熵最大化；使自由能最小化驱动力是非共价键——不是在溶液中形成；化学键比在溶液中强；是均匀的；把不同的分子弄乱是一种技术但并不是科学晶体形成的步骤：形成晶核——从低聚体开始；持续形成直到平衡（固液相互交换）；太多时会形成微晶体；太少时很少或者没有长晶体晶体生长——会有不同的时间、大小、数量和脆性长晶体的方法：蒸发扩散（最常用）——悬滴法；坐滴法扩散平衡——渗透；毛细现象：反扩散；微流体；立方晶相自动化——工业化规模、速度快影响晶体的因素：PH值和缓冲液类型浓度/天然沉降剂温度和温度波动离子浓度：主要盐浓度添加剂：金属盐、有机物和去垢剂配体、亚基、辅酶、抑制剂和促进剂大分子的纯度、稳定和浓度大分子来源：同源物还原或一氧化环境微生物中蛋白水解FXR、FGF调控胆固醇和胆酸的代谢途径？如何针对FGF降脂（胆固醇）。。。药物？答：BileacidsactivateFXRtoinduceFGF15insmallintestineandSHPinliver.FGF15issecretedfromintestinetoactivateFGFR4inliver.TheFGFR4signalingpathway（FGFR4→JNK-+HNF4→Cyp7A）cooperateswithSHPtorepressCYP7Ainliver.AlthoughSHPcontributestoFGF15-mediatedrepressionofCYP7A,SHP-independentmechanismscannotberuledout.由于肝脏中Cyp7A的表达受到了抑制，从而抑制了胆酸的合成。同时，此时胆固醇水平较低，进而进行胆固醇的合成。随着胆固醇水平的提高，通过LXRα受体，激活了肝脏中Cyp7a表达，从而又促进了肝脏中胆酸的合成。降脂药物：使用FXR受体的抑制剂，阻断FXR的生物学功能，从而阻断了FGF15的激活表达；或者使用FGFR4受体的抑制剂，最终均解除了FGF15对Cyp7a的抑制作用，使肝脏胆酸合成水平提高，从而降低了胆固醇水平。简述C.elegans基因功能研究中人们所采用的几种RNA干扰的方法，并比较它们的优缺点。（10）答：（1）注射双链RNA（dsRNA）优缺点：可直接将dsRNA注射到虫体生殖腺、内脏等任何解剖部位中。由于线虫中RNAi信号传播效应的存在,所以对不同的部位注射不会引起系统性差异。采用显微注射对仪器和操作人员的要求都很高，操作麻烦。（2）将线虫浸泡在含双链RNA（dsRNA）的溶液中优缺点：操作相对容易，但干扰效率较一般。（3）喂食E.coliHT115（表达dsRNA）优缺点：操作简单，可应用于线虫基因组水平的系统性RNA干扰。但需要对喂食的E.coli进行基因改造，使其可以产生dsRNA。简述凝胶阻抑电泳的原理及应用。（10）答：凝胶阻抑电泳是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术。其原理是DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率。当蛋白转录因子或调节因子与一条人工合成的特异的末端标记DNA或RNA探针结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合蛋白质的DNA或RNA探针，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。实验设计中主要有结合反应和竞争性结合反应，更进一步研究可以有SuperShift实验，即通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质。应用：用于定性和定量分析。最初用于研究DNA结合蛋白，目前也广泛应用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，并可进行未知蛋白的鉴定。请设计实验，用基因敲出的方法研究prohibitin在肝再生中的作用（注：prohibitin在胚胎发育中是必须的）（10）Prohibitin1234567答：由于prohibitin在胚胎发育中是必须的，因此，要用基因敲除的方法研究prohibitin在肝再生中的作用，应该选用条件性敲除的技术方法。并且该方法可以排除其它组织器官由于基因缺失对研究目的器官造成的影响。利用Cre／loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在Prohibitin基因外显子1之前和外显子2之后分别含有一个loxP位点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到Prohibitin基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于肝脏组织特异性基因启动子的调控之下，可以使其在肝脏组织中特异性表达。同时，为了避免在胚胎发育早期由于Prohibitin基因功能的异常所产生的副作用，可与控制Cre表达的外源性诱导系统相结合，如四环素调节系统，从而可以实现空间与时间的双重调控。最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠，当小鼠完成胚胎发育后，通过对四环素水平的调控，便可以获得肝脏中prohibitin敲除小鼠。两种来自同一种复合物的蛋白，一个约100个氨基酸，另一个约1000个氨基酸。为了研究它们之间的相互作用，需要制备蛋白样品。你的工作是要将两种蛋白表达和纯化。请你设计实验来表达和纯化它们。对于两种蛋白，你首要考虑的是什么？（10）答：蛋白质样品制备：有抽提法、人工合成法和异源表达（包括原核表达系统和真核表达系统）从原始的细胞、组织、器官中抽提——便宜；自然状态下的恰当修饰；来源有限人工合成：DNA、RNA、小分子和多肽——省时；相互作用设计；昂贵异源表达（原核载体和真核载体）——是稀有蛋白的有效获得途径；易于控制；耗时原核载体中蛋白表达：使用大肠杆菌或者芽孢杆菌已有的良好载体——但缺乏合适修饰若蛋白高修饰才能稳定，则不可用原核表达系统真核蛋白表达系统：酵母与丝状真菌——真核生物类似于细菌；啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母、裂殖酵母；一定的修饰；克隆筛选困难，低表达昆虫/杆状病毒——由于其安全性所以被用于商业生产，如：疫苗；高产量；更好的修饰但不同于天然构象；耗时，费钱；哺乳类（瞬转、稳转和病毒转染）——低可溶性；完全正确的修饰；低产出、省时、省钱蛋白质和核酸纯化：带有某种标签：His、GST、MBP、avidin、flag液相层析——离子交换：Q琼脂糖凝胶、SP琼脂糖凝胶；疏水的：苯基、丁醇琼脂糖凝胶；凝胶过滤：superdex和supharose；天然凝胶：PAGE在晶体筛选前进行蛋白质的鉴定：SDSPAGEforpurity,potentialcontaminationQuantification测浓度Bufferoptimization缓冲液优化—lowersalt低盐—Sufficientadditivesforprotection保护剂Stability—Gelfiltration:monodispersive单分散—Dynamicormulti-anglestaticstaticlightscattering:stoichiometry动力学和多角度计量光散射：化学计量，测分子量—Circulardichroism二向色性Activitytocheckfolding检测折叠—Enzymationegkinase,phosphatase—Bindingegligand,DNAorRNA—Responsetostimulieglight,Ca为了继续你的PH.D项目，你被要求获得蛋白复合物中这两种蛋白组分结构方面的可靠资料。假设你已经具备所有相关的仪器，请列举你要选择的方法，并说说它们的优缺点。（10）答：可以用：电子晶体衍射、X-射线衍射、中子衍射X-射线衍射：优点：分辨率高，达到原子分辨率既可研究水溶性蛋白，也可研究膜蛋白和大分子组装复合体能给出生物大分子的分子结构与构型，确定活性中心的位置和结构，从分子水平理解蛋白如何识别和结合客体分子，如何催化，如何折叠和进化的生命基本过程，继而阐明生命现象应用于测定蛋白和核酸晶体结构并结合分子模拟技术，为新药设计提供了新方向缺点：样品必须为晶体，但生物大分子结晶困难，切获得的结果是结晶状态的结构，非自然状态向并苏那样的大分子组装体，测量其精细结构十分复杂电子衍射VSX-ray衍射：ElectronsscatteredbyobjectnucleuswhileX-rayinteractswithobjectelectroncloudElectronsscattered106-107strongerSensitivetoboneelectronsMuchlargerradiusofEwaldsphere(λ0.02A)Diffractionangleθ=0-20whileX-rayto180AbletofromimagesX射线晶体学——X射线与晶体相互作用电子晶体学——电子与晶体相互作用（1）X-ray法要求晶体至少20μm，而电子与物质作用远强于X-ray，更适于研究微小晶体（2）X-ray是能以X射线的衍射数据来获得晶体结构信息；而电子晶体学不仅可以从电子衍射数据中得到警惕的结构信息，从电镜还可获得结构信息、电子来自电镜聚焦，利用电子显微镜三维结构的原理，通过有限个数的已知投影影像来近似重构生物体三维结构。（3）电子显微学可以电子衍射学结合，既可拍摄电子显微像（结构因子相位），又可拍摄电子衍射影像（准确的全部结构因子振幅）中子衍射：采用中子束来研究化合物的结构，与X射线衍射相比，应用分辨率水平宽，从核反应堆发射出的电子束是波长连续的辐射，没有特征谱线的出现。因此，它既可以在原子水平上确定原子位置，作为X射线晶体学和NMR（核磁共振）方法的补充，又可以作为电子显微波谱法的补充，在生物大分子组织水平上（~100A）用特殊的D标记研究生物大分子复合结构。对生物大分子产生射线伤害小既适用于溶液研究又适用于晶体研究，由于原子对中子辐射的吸收系数小，同时中子主要被原子核散射，核外e影响极小，散射振幅与原子系数无关，这些特点是中子散射有良好吸收和可比性，特别适于溶液中大分子与周围环境作用的研究。单色电子束强度较弱，用于单晶结构测定时，中子衍射VSX-ray衍射：中子衍射优点：Constantscatteringpoweratallangles持续的散射能量（从各个角度）NoradiationdamageandcanbedoneatRT没有辐射损伤，并可在常温下进行Veryprecisemeasurementforhydrogen对于测定H原子非常精确Noneedorstructurefactorforelectrondensitybecauseitinteractswithnuclei中子衍射缺点：ManyterminationerrorsinFouriermapsRequiresignificantlargecrystals(>0.1mm2ofen1-10mm3)07年诺贝尔生理或医学奖得主？工作技术路线？工作意义？答：得主：瑞典卡罗林斯卡医学院８日宣布，２００７年诺贝尔生理学或医学奖授予来自美国的马里奥·卡佩奇、奥利弗·史密斯和来自英国的马丁·伊文思因胚胎干细胞研究获该奖项。获奖是因为他们“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”，他们“发现了利用胚胎干细胞对老鼠基因进行特定改变的原