感染性疾病的临床分子生物学检验分子生物学检验技术生物化学检验教研室课件

分子生物学检验技术“感染性疾病”的临床分子生物学检验生物化学检验教研室感染性疾病指致病微生物（包括细菌、病毒、真菌和寄生虫、衣原体、支原体、立克次体等）病原体及其产物通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。大约70%的人类感染性疾病是由病毒引起的，有超过400种以上的病毒可感染人类。传染病是感染性疾病的一种特殊类型，归类于感染性疾病，由传染源协带病原体，通过一定的传播途径进行播散的疾病。感染性疾病由外界致病病原体侵入人体后导致，如伤寒、病毒性肝炎。外源性感染内源性感染指由人体自身的正常菌群，在人体免疫功能下降时引起的感染，因这些细菌必须在一定条件下才能致病，所以又称条件致病菌。如，肠道菌群中的大肠杆菌、肠球菌等。感染性疾病分类01按病原体分类：可分为细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等。02按病原体来源分类：可分为內源性感染和外源性感染。03按疾病特征分类：阴性感染（亚临床感染）、潜伏感染、显性感染（按病情缓急分为急性感染、慢性感染；按感染部位分为局部感染和全身感染）。常用诊断技术（一）形态学检测技术01光镜检查是确定很多感染性疾病病原体的最基本和快速的方法。02电镜检查主要对病毒感染尤其具有快速诊断价值。03分离培养使感染性疾病得以确诊，而且以此建立的药敏试验可指导临床合理用药。常用诊断技术（二）免疫学检测技术01免疫荧光技术（IFA）用荧光素标记抗体分子，借助荧光显微镜检测相应抗原。广泛应用于病毒感染性疾病。02酶免疫技术（EIA）高度特异性和敏感性。03间接凝集反应常用于流行病学调查和筛选阳性标本。直接检出细菌抗原，有利于早期诊断。常用诊断技术（三）流式细胞术（FCM）可快速多参数分析细胞特征，显示细胞的DNA,RNA水平和体积大小。临床上逐步用于多种细菌、病毒、真菌、寄生虫的检测技术及鉴定。常规检测方法，受到敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。常用诊断技术（四）基因诊断技术01核酸杂交技术：常用斑点杂交、Southern印迹、Northern印迹、原位杂交等。特异性比免疫学检测更高。02核酸扩增技术03基因定量诊断技术：实时荧光定量PCR法为目前应用最广的基因定量诊断技术。用于病情评估、疗效预测、预后判断等。具有重要临床应用价值。04基因芯片技术：可用于病原体变异株、基因分型、耐药基因等检测。PCR项目编号代码一、感染性疾病的诊断和治疗监测对病原生物进行种属鉴定、基因分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测、流行病学调查等。如：病毒性肝炎SARS结核病艾滋病人禽流感新冠状病毒……感染性疾病的分子生物学检验策略一般性检出策略（检出病原体）完整性检出策略判断有无感染是何种病原体感染常用方法：PCR

＋杂交检出病原体分型（分类）－亚型－耐药性常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序病毒基因检测对病毒特异性基因序列和基因结构进行直接测定。检测方法病毒基因保守序列的扩增检测特异性核酸序列杂交基因芯片技术支链DNA技限制性片段长度多态性分析基因序列测定病毒基因检测确定病毒存在与否。通常选择病毒基因组保守序列作为检测，来设计PCR引物或制备特异性探针。一般检测策略完整性检出策略进一步检测病毒载量、进行病毒基因分型、亚型鉴定、病毒耐药基因分析。病毒基因检测HBV、HPVHCV、HIV其DNA可以使用点杂交、PCR方法直接检出其RNA可以使用RT-PCR方法直接检出（一）乙型肝炎病毒全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区；每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因；中国：50%~70%的人受过感染，8%~12%是HBV携带者；肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬化，HBV又与原发性肝癌密切相关。（一）乙型肝炎病毒HBV是一种DNA病毒属于嗜肝DNA病毒科。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状,丹娜颗粒（Dane）。1965年由丹娜发现。直径为42nm。颗粒分为外壳和核心两部分。（一）乙型肝炎病毒HBV结构示意图外壳（HBsAg）外壳蛋白成分为表面抗原核心（HBcAg）DNADNA聚合酶HBcAg（一）乙型肝炎病毒基因组长3.2kb，两条链长度不等。长链为负链，长度固定，携带病毒全部编码信息，为模板编码病毒蛋白。短链为正链,在不同的分子中长度不等，约为负链的50%-100%。（一）乙型肝炎病毒负链DNA核苷酸序列上含有6个开放阅读框，其中S、C、P、X共4个ORF是早已公认的。多个ORF可读码两次以上，编码2个以上蛋白质。S基因区编码外膜蛋白前S1区前S2区S区（HBsAg）主要外膜蛋白前S区与病毒的嗜肝性有关C基因区前C区C区87个核苷酸组成，编码29个氨基酸残基组成的多肽，称为功能性信号肽。由549个核苷酸组成，编码产物为183个氨基酸组成的多肽序列，称为C蛋白（HBcAg）。整个C基因区编码212个氨基酸残基组成的多肽称为乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。P基因区最大的一个ORF，与其他基因区均有重叠，编码产物是乙型肝炎病毒DNA的多聚酶蛋白（HBVDNAP），此酶具有逆转录作用。P基因区中某些核苷酸也会发生点突变，造成此蛋白表达水平减少或完全阻断。X基因区最小的一个ORF，编码产物为X蛋白（HBxAg）。可能与表达调控，DNA整合有关。X蛋白所诱生的抗体常见于原发性肝细胞癌患者体内。HBV的复制在复制过程中有逆转录过程，与逆转录病毒相似，逆转录后的DNA可整合到靶细胞的染色体。DNARNADNA转录逆转录HBV的复制外衣壳抗原内衣壳抗原表面抗原HBsAg前S1抗原前S2抗原核心抗原HBcAg

e抗原HBeAgHBV的复制pre-S1HBsAgpre-S2S区C区P区X区pre-S1pre-S2Spre-C+CCPX编码pre-S1蛋白pre-S2蛋白HBsAg（S蛋白）HBeAgHBcAg（C蛋白）DNAP（P蛋白）HBxAg（X蛋白）HBV的分子生物学检验荧光定量PCR技术：测定HBV病毒载量。支链DNA（bDNA）技术：一种不依赖PCR的，核酸探针杂交信号放大技术。荧光PCR法竞争PCR法PCR酶联免疫吸附法荧光标记物法PCR酶联化学发光……HBV的分子生物学检验HBVDNA检测（PCR）PCR：引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。扩增位置引物序列扩增片段大小（bp）P、X基因特异片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’Ｃ基因特异片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特异片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’部分常用的引物序列HBV分子生物学检验临床意义早期诊断监测治疗效果（病毒拷贝数）判断病情耐药检测HBV分子生物学检验临床意义弥补血清学检测结果，早期诊断HBV；缩小窗口期，快速诊断；病毒载量检测，了解病情：判断HBV复制水平和传染性强弱的直接标志。可作为治疗方案和疗效观察的指标。>109拷贝/mL，日常生活密切接触强传染性。>105

～106拷贝/mL，日常生活密切接触传染性小。<105拷贝/mL，日常生活密切接触几乎没有什么传染性危险性。但不管HBV-DNA的浓度为多少，那怕是低于相应PCR方法的测定下限，也均会引起输血后的感染。病毒基因分型目前HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型。不同HBV基因型的患者的肝细胞损伤程度、对治疗的应答、疾病转归等均有不同。如，干扰素对B基因型效果好，C基因型患者较B型肝功异常更为常见。检测耐药突变检测，指导用药耐药性HBV的高变异性（逆转录酶缺乏严格的校正功能）人体免疫应答或疫苗接种等压力。最常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉米夫定、阿德福韦。针对HBV-DNA聚合酶P基因（HBVDNAP）的检测，即鉴别野生型（YMDD）,耐药突变（YVDD/YIDD）。如，拉米夫定耐药突变集中在552位蛋氨酸的YMDD转变成缬氨酸YVDD/异亮氨酸YIDD，其中M552V是其耐药突变的主要形式。检测耐药突变检测，指导用药YMDD基序作用原理拉米夫定与YMDD变异YMDD拉米夫定dNTP负链DNAHBVDNAPYI/VDD拉米夫定dNTP低亲和力负链DNAHBVDNAP发生临床耐药变异株与耐药突变检测在人体活疫苗接种、抗病毒治疗等压力下HBV基因组的变异血清学检测指标的改变HBV感染发病机制的变化免疫逃逸（二）人乳头瘤病毒（HPV）是一种嗜上皮性病毒，具有高度的组织和宿主特异性及将正常细胞永生化能力。可致人类皮肤黏膜异常增生，引起良性肿瘤和疣，如，寻常疣、尖锐湿疣、乳头状瘤，或导致癌变，如宫颈癌，是一种常见的性传播疾病。基因结构特征是一种无包膜的双链闭环的小型DNA病毒。球形。DNA核心蛋白衣壳主要衣壳蛋白（L1）次要衣壳蛋白（L2）基因组分三个区段01早期区（E）：4kb，分为E1-E8开放阅读框。与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关。E1、2、5、6、7在上皮分化早期阶段表达，其中E6、7是潜在的致癌基因，编码病毒原癌基因。03长控制区（LCR）：位于E区和L区之间，长约1Kb。02晚期区（L）：3kb，有两个主要ORF，分别是L1，L2。不同的HPV亚型的L区DNA序列变异很大，为不同亚型分型的重要标准之一。基因组分三个区段HPV的分子生物学检验01HC-II检测系统是一种非放射性的分子杂交化学发光信号放大系统，也是目前唯一获得美国FDA许可的HPV检测方法，可快速检测出18种HPV（包括13种高危型和5种低危型）。HPV的分子生物学检验HPV的分子生物学检验02PCR技术荧光实时定量PCR法，杂交PCR。所用引物设计在HPV-DNA的高度保守区，若结合探针杂交可保证检测结果的特异性，便可设计特异性引物对HPV进行分型。03基因芯片技术利用通用引物扩增待检样本，再与固定在芯片上的亚型特异性探针进行杂交，显色并判断结果。适合高通量HPV筛查。HPV分型高危型、高病毒载量、持续感染是促进宫颈癌发生的重要因素。根据不同型别HPV与癌症发生的危险性高低将人类感染性HPV分为高危型和低危型。只有高危型的HPV持续感染才有患高度宫颈病变的风险，高危型约20种，最经典的有13种。不同地区人群感染率及感染型别不同。HPV分型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等。宫颈上皮肉瘤样变和宫颈癌。高危型低危型HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、cp6108等。生殖道及肛门周围皮肤湿疣病变；低级别宫颈上皮肉瘤样变，多呈现一过性，可自然逆转。HPV分子生物学检验的临床意义01宫颈疾病风险预测HPV-DNA检测发现高度病变的敏感度为97.7%-100%，比细胞学检查高20%以上，是宫颈癌筛查的优选方法。根据感染的HPV类型预测发病风险度，当细胞学和HPV检测均为阴性时，阴性预测值可达到99%-100%，表明其发病风险低，筛查间隔可延长至5年。HPV分子生物学检验的临床意义02疗效评估和术后跟踪在HPV感染治疗前后，出现病毒量或感染病毒类型变化，可作为治疗评估指标。03预防控制及疫苗研发疫苗使用只针对没有感染过HPV16、18、11类型人群，因此疫苗注射前进行HPV分型检测尤为重要。病原菌基因检测1.意义：2.鉴定病原菌（分子标志物）：3.耐药株测定4.流行株分型不易培养的病原菌（营养苛求菌）难以培养的病原菌（生长缓慢）DNA

16SrRNA（属特异性）23SrRNA（一）结核分枝杆菌据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。近年，因艾滋病和结核分支杆菌耐药菌株的出现、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。生物学特性与致病性结核分枝杆菌革兰氏阳性菌，用抗酸性染色被染成红色。细胞壁中含有大量脂质。生物学特性与致病性馋懒营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏）。生长缓慢，15-20h分裂1次，在固体培养基中4-6w才见菌落。丑菌落粗糙，如菜花样。感染方式呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜侵入人体。在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤。引起的疾病呈慢性，并伴有肉芽肿。基因结构特征共价封闭环状双链结构；标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb，包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因，GC含量丰富。基因结构特征01重复序列如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有复合群特异性。02蛋白质编码基因03rRNA基因每个细胞约含有103～104个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列。结核分枝杆菌分子生物学检测常规标本直接涂片染色镜检分离培养鉴定血清学抗原检测方法结核分枝杆菌分子生物学检测细菌培养耗时4-8周菌种鉴定、药敏试验再加4-8周抗酸涂片灵敏度低，易漏诊不能区分TB/NTM结核分枝杆菌分子生物学检测分子生物学检验方法是直接以结核杆菌的种属特有基因和耐药相关基因为检测对象。TB检测中常见临床标本：痰、胸腹水。标本前处理：用液化剂除去黏蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典方法提取DNA。分枝杆菌分子生物学诊断法系统分枝杆菌核酸检测实时荧光PCR分枝杆菌菌种鉴定结核分枝杆菌耐药基因检测PCR-RFLP基因芯片快速检测平台筛查、鉴别诊断菌种鉴定MDR早期诊断TB分子生物学检验的临床意义01早期