化学发光杨晓林省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

发光免疫检测技术临床应用

及其应注意问题杨晓林博士北京大学医学部研究员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员国际生物发光和化学发光学会(ISBC）学术理事CouncilmemberofscientificadvisoryboardofInternationalSocietyonBioluminescence&Chemiluminescence第1页因为化学反应（通常是氧化）产生电子能级处于激发态物质，后者经过跃迁释放能量产生光子，从而造成发光现象。化学发光

（Chemiluminescence）生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是因为发光体温度升高所至，发射波长也与其温度无关第2页按化学反应类型化学发光分类酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：

吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统闪光（Flash）:按发光连续时间发光时间在数十分钟以上，如：HRP-Luminol系统AP-AMPPD系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、以速率法测量。发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(InSituInjector)和时间积分法测量辉光（Glow）:第3页时间发光信号辉光坪区速率法测量原位进样积分法测量闪光尖峰闪光与辉光及其测量方式差异第4页鲁米诺及其衍生物增敏化学发光系统H2O2+NH2OONHNHN2OH-HRPNH2CO2-CO2-+Photon(425nm)ROHROHNSRBOHOH增强剂（Enhancer）商业化产品中常见化学发光系统第5页AMPPD及其衍生物化学发光系统+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3OO-OOCH3商业化产品中常见化学发光系统第6页CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光子+CO2+CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商业化产品中常见化学发光系统吖啶酯化学发光系统第7页发光信号检测光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）结构简单、性能稳定但灵敏度低、线性范围较窄。主要特点原理光信号光电转换器件电压或电流信号放大第8页单光子计数器是当前高灵敏度发光分析仪关键部件光电倍增管高压高速放大器高速比较器高速分频器发光样品产生光子激发光阴极产生光电子在阳极上形成较强信号脉冲信号相对发光单位数字脉冲(RLU)在各打拿极之间得到能量和数目标倍增第9页单光子计数式发光检测仪计算机打印机发光仪控制模块发光仪执行模块控制器程控高压计数/贮存器单光子计数器样品运动/定位装置程控自动门锁及检测装置原位注射泵第10页光生物学技术应用范围军事侦测公安稽查卫生检疫药品筛查医学诊疗环境检测航天遥感生命科学……

已成为当代生物技术最活跃领域之一第11页光生物学检测技术优越性彻底消除了放射性危害无半衰期限制，试剂稳定性和使用期大大延长轻易实现连续、动态、重复测定适合于复合标识系统进行多指标并行测定操作简单，反应速度快，轻易实现自动化灵敏度和线性范围超出以往技术第12页几个标识/检测技术灵敏度比较酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9第13页几个标识/检测技术线性范围比较酶标荧光放免发光线性范围105104103102第14页几个标识/检测试剂使用期比较酶标荧光放免发光使用期（月）1815129630第15页020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒仪器特殊防护治理污染人民币人民币三种免疫测定技术成本及费用三种免疫测定技术成本及费用放免酶标发光第16页抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答物质。抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质球蛋白。免疫分析技术基本原理利用抗原、抗体之间特异性结合来测定、分析特定物质方法第17页免疫测定技术分类反应结束后是否需要分离均相法（Homogeneous）非均相法（Heterogeneous）第18页均相法（Homogeneous）免疫凝集法：自然凝集：血型测定肥达氏反应；敏化凝集：血球凝集法凝胶（微粒）比浊法免疫扩散法；免疫电泳法近场液闪法，酶--辅酶（亚基）配位法荧光偏振法，荧光共振法吖啶酯水解法，生物传感器第19页非均相法（Heterogeneous）免疫印迹（Western-blot）：基因表示分析、HIV感染确认试验免疫组织化学技术：原位基因表示分析、临床病理学分析纸片法：早孕快速检测、吸毒检测快速、献血快速检测放射免疫法（RIA）：沉降法（放免）、固相法（免放，IRMA）荧光免疫法（FIA）；酶联免疫法（EIA，ELISA）酶联荧光法（FEIA）、化学发光法（LIA）酶联化学发光法（ELIA）、时间分辨荧光法（DELFIA）、电化学发光法（ECLIA）；……第20页双抗体夹心法（三明志法）原理固相支持物表面包被抗体标识抗体待测物第21页夹心法剂量--反应关系曲线信号强度（Y）线性范围待测物浓度（X）Hook(前滞)效应分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0+2SD在该曲线上所对应浓度值。功效灵敏度：测定误差（变异）≤20%最低可检测浓度。线性范围：（分析）功效灵敏度---变异≤20%最高检测浓度相关系数≥0.99曲线范围第22页竞争法原理固相支持物表面待测物包被抗体标识抗原第23页竞争法剂量--反应关系曲线待测物浓度（X）信号强度（Y）线性范围分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0-2SD在该曲线上所对应浓度值功效灵敏度：测定误差（变异）≤20%最低可检测浓度线性范围：

（分析）功效灵敏度---变异≤20%最高检测浓度相关系数≥0.99曲线范围第24页间接法原理包被体待测抗体包被抗原标识抗体（二抗）第25页俘获法原理俘获抗体（二抗）待测抗体标识抗原包被体第26页双抗原夹心法原理包被体待测抗体包被抗原标识抗原第27页间接包被夹心法原理包被体待测抗原包被连接物标识抗体俘获抗体特点：全部试剂盒均采取同一包被物和包被工艺第28页发光免疫分析基本操作步骤（一步法）待测样品标识抗体或抗原洗涤去除未结合反应物发光底物仪器检测包被抗体或抗原反应管反应30-60分钟反应0-5分钟第29页发光免疫分析基本操作步骤（二步法）待测样品洗涤去除未结合反应物发光底物仪器检测包被抗体或抗原反应管反应30-60分钟反应0-5分钟标识抗体或抗原洗涤去除未结合反应物反应30-60分钟第30页发光免疫分析技术现实状况及应注意问题第31页当前已商品化光生物学标识检测技术整体性能比较技术类型标识、反应体系主要优点主要不足化学发光酶促过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂等测量方式简单（速率法）成本较低、灵敏度较高工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移螺旋金刚烷环氧化物、碱性磷酸酶测量方式简单（速率法）灵敏度较高非酶促吖啶酯、过氧化氢灵敏度较高试剂成本高、发光时间短测量方式复杂（积分法）需原位进样(InSituInjector)仪器成本及维护费用较高试剂成本较高时间分辨荧光铕（Eu）、镝(Dy)、钐（Sm）、铽（Tb）、等络合物脉冲光源激发灵敏度较高、试剂较稳定测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流动池）仪器成本及维护费用高环境及样品中同类元素可造成本底干扰电化学发光钌(Ru)络合物脉冲电场激发时间分辨荧光（也称时间延迟光致发光）：TimeResolvedFluorescence（TimeDelayedPhotoluminescence）解离增强荧光免疫分析（DEFIA）电化学发光（也称场致发光）：Electrochemiluminescence（Electroluminescence）化学发光：Chemiluminescence第32页比如：电化学发光TSH检测试剂分析灵敏度为0.005mIU/L第四代化学发光TSH检测试剂分析灵敏度为0.001mIU/L原因在于抗体亲协力，而不是检测技术。筛选抗体、屏蔽干扰，生产工艺、管理水平和技术服务是试剂生产关键这些发光检测技术灵敏度及线性范围都已经靠近了免疫反应极限。灵敏度瓶颈在于抗体亲协力和干扰免疫反应原因，而不是检测技术。片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围强弱，不但毫无意义，而且也是荒谬。第33页发光技术——临床免疫分析划时代进步以TSH(促甲状腺素)为例第一代TSH检测试剂盒普通放免功效灵敏度1-2mIU/L基本无法测到正常值下限以下血清TSH浓度对甲亢诊疗意义不大固相放免功效灵敏度0.1-0.2mIU/L在甲亢诊疗中开始发挥作用第二代TSH检测试剂盒发光免疫功效灵敏度0.01-0.02mIU/L成为甲亢诊疗首选指标之一发光免疫功效灵敏度0.001-0.002mIU/L一系列新临床现象改写了垂体甲状腺轴调控状态第三代TSH检测试剂盒第四代TSH检测试剂盒第34页当前商品化发光免疫分析产品几个特点大多采取全自开工作方式，部分采取微孔板半自动方式多数采取磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积，使灵敏度深入提升，反应时间大大缩短使用内建标准曲线加校正方法产生工作曲线部分产品采取流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光)第35页流动池检测方式示意图检测器检测池负压泵废液四通阀冲洗液样品管计量泵干燥空气原位进样泵氧化剂第36页使用商品化发光免疫分析产品可能碰到几个问题与以往方法（放免等）在检测指标正常值及临床意义上差异。如：免疫源性胰岛素与真胰岛素、HCG、性激素等采取不一样单抗或多抗时检测结果也有较大差异。（单抗特异性好，受干扰小，所以测值低）不一样厂家产品测定结果之间一致性差（未与国家标准品比对）。所使用内建标准曲线结合校正方法不尽完善。部分产品不显示原始数据，无法监控其准确性。第37页免疫分析结果干扰原因温度氧化剂还原剂光线磁场金属离子防腐剂杂质本底物质第38页同一干扰原因对不一样检测方法不一样影响待测物包被（结合）抗体放免法免放或发光法标识抗原TBG离心沉降洗涤祛除以甲状腺素结合蛋白（TBG）干扰竞争法测定T3为例信号↑结果↓信号↓结果↑第39页使用商品化发光免疫分析产品必须做好几个工作在厂家提供数据基础上，自行建立正常参考值系统。明确各个试剂盒特异性及交叉反应情况如：小分子激素之间，以及与本身前体或代谢物之间交叉胰岛素与C-肽、胰岛素原之间交叉FSH、LH、HCG之间交叉。充分利用现有国家标准参考品校正结果（注意防腐剂干扰）（能够从国家药品生物制品检定所或临床检验中心得到）自行建立多点质控（2-3点）监控每次试验准确性。尽可能防止干扰原因采样：清洁样品管（预防还原剂干扰）、不使用酶抑制剂、及时送检试验室：恒温、防止强光和强磁场、严格操作规程、及时维护、报修第40页正常值参考意义及灰色区域存在假如测定结果处于灰色区域（约在正常值上下限以内20%）内，则需要深入追踪检验。95%或99%-20%+20%第41页本身基础数据——最正确“正常参考值”对于患者来讲，最正确参考值是自己以往测定数据，即本身对照；所以积累病人基础数据非常主要。尤其是性激素、生长激素、胰岛素等含有周期性分泌或释放规律激素。时间FSH卵泡期排卵期黄体期月经期正常人平均值改变规律正常参考值范围某一患者改变规律（无排卵峰）第42页确保检验结果准确性对该检验项目或其检验结果普遍意义解释不要试图替临床大夫为某一详细病例作出最终诊疗建立和完善试验室面向临床大夫乃至患者咨询制度检验医师必须切记检验医师给临床所提供一切服务仅限于第43页化验结果与临床不符原因因为个体差异或不明干扰原因存在，总有少数病例化验结果与其临床表现不符操作失误、仪器故障、试剂失活等原因一些夹心一步法试剂往往存在前滞效应药品以及其它基础疾病干扰排除这些原因后重复测定或重复送样用同试剂盒校准品A稀释后再重新测定及时与临床沟通结合说明书综合判断原因处理第44页不一样试验方法，或同一方法不一样厂家产品之间，其测定结果和临床正常值都会有所差异不一样试验室环境和不一样人群条件下，其测定结果和临床正常值也会有所不一样在厂家提供正常参考值基础上建立自己正常参考系统待测物质降解及其与血清蛋白结合状态改变，一些化验项目标检测结果往往受标本存放时间及其贮存条件影响及时采样、送检，试验室及时完成化验，严格按照试剂盒说明书要求存放第45页常见临床免疫检测指标意义及其限制原因第46页激素类型氨基酸：甲状腺激素蛋白（肽）：甲状旁腺激素、下丘脑激素、垂体激素、降钙素、胎盘激素、心肌激素、胃肠激素类固醇：性激素和皮质激素儿茶酚胺：肾上腺素下丘脑-垂体-内分泌轴及其调整关系长反馈：垂体或下丘脑激素受靶细胞分泌激素反馈调整，以负反馈为主，但排卵时雌激素为正反馈。短反馈：垂体激素对于下丘脑反馈负反馈超短反馈：下丘或垂体激素直接负反馈本身合成和分泌第47页类固醇激素合成男女性激素和皮质激素均起源于共同前体和合成、代谢路径，其结构也非常相同。所以皮质功效紊乱、肝肾功效紊乱、一些遗传缺点、服用类固醇药品等均可造成这些激素测定结果异常。第48页甲状腺功效指标评价甲亢诊疗价值依次为：TSH=FT3＞FT4＞TT3＞TT4甲低诊疗价值依次为：FT4=TSH＞TT4＞FT3＞TT3发光法TSH、FT3、FT4提升了灵敏度，使得其临床意义大于TT4和TT3两步法操作时间长灵敏度差准确性差类似物法操作时间短灵敏度很好准确性很好反向竞争法（标识抗体）操作时间短灵敏度更加好准确性更加好第一代第二代第三代血清FT3、FT4试剂盒发展（消除结合蛋白对测定影响）TGAbTMAb=TPO抗体第49页其生理作用需要经过生长介素(SM)介导SM也称胰岛素样生长因子(IGF)，主要在肝脏及各种GH靶细胞合成SM-C即IGFI，结构与胰岛素有近二分之一氨基酸残基相同。生长激素（GH）生长激素紊乱生长激素缺乏症（侏儒）巨人症及肢端肥大症GH测定临床意义垂体腺瘤、肾癌、肺癌运动刺激试验药品刺激试验（胰岛素-低血糖试验）GH分泌抑制试验第50页胰岛素免疫源性胰岛素：采取多抗或普通单抗与胰岛素原和C肽有交叉正常值较高糖尿病分型：Ⅰ型空腹胰岛素低，OGTT后改变迟缓，甚至无改变；Ⅱ型空腹高胰岛素，OGTT后胰岛素释放延迟，总量不低。肝硬变：空腹胰岛素高于正常2－3倍。OGTT各个时相胰岛素升高。胰岛素瘤：静脉注入亮氨酸后血中胰岛素水平显著升高。甲亢：早期空腹胰岛素水平高，OGTT与正常人相同；长久严重甲亢可造成胰岛β细胞功效衰竭，发展为糖尿病。真胰岛素：采取胰岛素原掩蔽性胰岛素单抗与胰岛素原和C肽无交叉正常值较低第51页C-肽胰岛素升高C肽正常，外周血C肽／胰岛素比值降低。糖尿病如患者存在胰岛素抗体或用外源性胰岛素治疗，则改为测定C肽肝硬化生理性升高：禁食及大量活动病理性升高：糖尿病，增高数值和糖尿病严重程度相关胰高血糖素胰高血糖素静脉注射试验胰高血糖素瘤判别评价糖尿病人胰岛功效第52页胰岛素抗体GAD是Ⅰ型糖尿病关键始动靶本身抗原其抗体是Ⅰ型糖尿病及前期主要标志长久用胰岛素病人可产生未用过胰岛素I型糖尿病人胰岛素抗体阳性是本身免疫性细胞损害标志谷氨酸脱羧酶（GAD）抗体与抗胰岛细胞抗体（ICA）相比，GAD-Ab阳性率高、连续时间长、测定方法简单，有很好临床预见性，可替换ICA。第53页性激素LHFSH正常婴儿和小孩极微；在青春期前开始分泌；女性绝经后显著升高。成年男性含量比较恒定，老年男性因睾丸功效衰减，含量大大升高。垂体瘤切除术后患者LH和FSH降低，预计垂体瘤手术效果有一定价值性腺发育不良垂体瘤一些癌症（肺癌）慢性肾衰腺皮质激素治疗后异位激素分泌综合征……垂体性性功效衰退神经性厌食使用性激素溢乳闭经征青春期延期……第54页催乳素瘤好发于女性表现为泌乳闭经多毛痤疮不育垂体催乳素（hPRL）垂体催乳素瘤、月经异常和不孕病因判别，应激刺激可引发hPRL分泌。男性以性功效减退阳萎不育垂体压迫症状为主偶见泌乳。第55页睾酮睾丸间质细胞瘤真性男性性早熟女性多毛症皮质醇增多症完全性雄性激素不应综合征……原发生睾丸功效减退垂体前叶功效减退男性不育高hPRL血症红斑狼疮骨质疏松慢性肝病慢性肾衰……血液中睾酮98%与蛋白结合，只有游离态含有生物活性女性性早熟男性乳房发育红斑狼疮肝硬变子宫内膜癌乳腺癌糖尿病孕妇……女性性发育不全多囊卵巢综合症葡萄胎妊娠高血压症柯兴氏综合症卵巢囊肿……雌二醇灵敏度要求高第56页多胎妊娠17α-羟化酶缺乏症子宫内膜腺癌先兆子痫妊娠高血压妊娠合并糖尿病胎儿宫内生长迟缓卵巢颗粒层膜细胞瘤……无排卵性子宫功效性出血闭经不孕早产黄体功效不全异位妊娠……孕酮血浆中孕酮绝大部分为结合型，极小数为游离型。孕酮与黄体及胎盘关系亲密，用于监测排卵、黄体功效以及判断妊娠继续。第57页小分子性激素测定方法进展（消除蛋白结合和类似物/前体/代谢产物干扰）直接测定法经典方法消化样品↓萃取有机相↓分子筛柱分离各类甾体↓测定血清直接测定+高特异性单抗+结合蛋白屏蔽技术第58页hCG游离β亚单位试剂β亚单位特异且不与完整hCG分子结合单抗专门测定hCG游离β亚单位多用于唐氏综合征早期筛查。绒毛膜促性腺激素（hCG）临床意义早孕、先兆流产监护、异位妊娠、葡萄胎、绒癌、精原细胞瘤肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌、畸胎瘤、唐氏综合征等。普通型试剂多抗受其它激素干扰灵敏度不高βhCG试剂β亚单位特异单抗特异性和灵敏度较高第59页分类:特异性——特定肿瘤时才会显著性升高

辅助性——正常情况下也可产生，在发生肿瘤时急剧升高肿瘤标志物定义：由肿瘤细胞合成、释放，或者是机体受肿瘤刺激而产生物质。用途：高危人群早期筛查肿瘤确诊病人疗效观察和预后分析。性质：胚胎源性、含糖物质、酶、激素，其它蛋白质不能单纯依赖肿瘤标志物确诊肿瘤第60页原发性结肠癌（45－90%）腺胰、胆管、胃、食道、肺、乳腺癌和泌尿系肿瘤（50－70%）结肠癌术后1－3周内血CEA可下降到正常，如连续阳性说明切除不全或转移，提醒预后差或有复发可能乳头状癌时胆汁CEA检测特异性100%良性肿瘤、炎症和退行性疾病、吸烟者可小幅升高原发性肝癌（90%）手术疗效和预后判断指标其它肿瘤（胃癌、结肠癌）

各种胎儿发育缺点、低氧症、死胎肝良性病变（肝炎）轻度增高甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）升高唐氏综合症降低第61页上皮性卵巢癌和子宫内膜癌标志物浆液性子宫内膜样癌、透明细胞癌、输卵管癌、未分化卵巢癌卵巢癌复发早期增高良性卵巢疾患（3%-6%）、怀孕期前3个月、行经期、子宫内膜异位症、子宫纤维变性、急性输卵管炎、肝病、胸腹膜和心包感染可稍有上升CA15-3乳腺癌（30-50%）、肺癌、肺腺癌及卵巢癌乳腺癌术后复发转移妊娠可引发升高CA125胰腺癌和结、直肠癌，肿瘤切除后如再次上升表示复发。胆囊癌、胆管癌、肝癌、胃癌也升高胆道癌胆汁检测灵敏度100%胰腺癌胆汁检测灵敏度76.5%,特异性96.4%胰腺炎和黄疸时可呈一过性增高普遍性肿瘤标志相关抗原，不是特指某个器官肿瘤标志物。胰腺癌、胆囊癌（90%）；肝癌、胃癌、结直肠癌、卵巢肿瘤胰腺炎、结肠炎和肺炎时，也会升高CA50CA199第62页是当前小细胞肺癌最敏感最特异肿瘤标志物之一，阳性率65%-100%NSE水平与小细胞肺癌转移程度相关，与转移部位无关治疗前后动态观察血清NSE浓度能够监测小细胞肺癌治疗效果。水溶性铁贮存蛋白，含有不一样同工铁蛋白图谱。酸性同分异构体铁蛋白增高与白血病、肺癌、乳腺癌相关肝癌时假如AFP测定值较低，可用铁蛋白测定结果作为补充证据色素从容旺盛、炎症，尤其是肝炎时，铁蛋白也会升高神经元特异性烯醇化酶（NSE）铁蛋白（Frri）第63页当前国际上强调用等克分子反应单克隆抗体检测PSA，不然测定值偏高。但美国很多企业甚至大企业各种PSA试剂盒均未采取等克分子抗体，当前在欧洲已被逐步排挤出市场。前列腺特异抗原(PSA)前列腺癌筛查和治疗后监控良性前列腺疾病也可升高女性乳腺癌患者中可检出FPSA/TPSA值25%良性前列腺增生前列腺癌0100%前列腺癌特异性标志物，少数几个器官特异性肿瘤标志物之一第64页地高辛测定易受地高辛一些代谢物，以及一些内源性类固醇物质干扰取血应在服药10天以后及最终一次服药16小时（出现中毒除外）0.82.03.04.0ng/ml血清浓度治疗剂量＞80%病人心律紊乱治疗心房纤颤和心房扑动除外高度怀疑中毒注意特征性心率失常和心电图改变必须停药考虑抢救办法第65页MoM正常人群中位数倍数，即正常人群为1.0MoM唐氏综合征试验室诊疗母体血清AFP低于1.0MoM（0.47-0.86MoM，均值0.65MoM）母体血清游离β-hCG亚单位孕早期显著高于正常妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)孕早期显著降低PAPP-A和游离β-hCG亚单位联合应用8-14周时检出率62%，假阳性率为5%；孕15-22周检出率为59%第66页1987年研究，1991年申请化学发光液专利（几乎与国外同时）。1995年取得上述专利，开始研制单光子计数式发光仪。1997年研制成功第一代微孔板单光子计数式发光分析仪,开发出部分发光免疫试剂盒。年取得单光子计数器专利，开始发光免疫检测试剂盒新药申报。年获医疗器械和药品生产许可证，正式批量生产。源德发展历程第67页自主开发出含有国际水平发光底物在国际上率先创建分程增敏、辅助增敏、坪区延长和干扰屏蔽技术使发光灵敏度和线性范围均比同类技术提升一个数量级坪区（信号稳定时）和抗干扰能力也显著提升因而使试剂盒稳定性、线性范围超出了国外同类产品而且还克服了酶促发光固有工作曲线漂移、低端斜率非线性下降等不足第68页第69页第70页本底噪音最低检测限线性范围稳定性（RLU/0.1秒)(HRPpg/样品)(HRPpg/样品)(平均变异系数)

某国外产品27±3.10.1±0.010.1--204