蛋白质组学及其在医学研究中的应用课件

蛋白质组学及其在医学研究中的应用

一、概述最早于1994年由澳大利亚一位博士后Wilkins提出,指的是“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。”整体性、动态性和系统性RepresentationofaeukaryoticCell

定义：蛋白质组学(proteomics),就是从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.二、蛋白质研究的简要史1975年双向凝胶电泳技术1986年第一个蛋白质序列数据库-SWISSPROT1997年

出版了第一部蛋白质组学的专著

2000年3月首次发表了一个生物体的完整蛋白质组2001年6月和2001年2月公布了人类基因组框架图和序列图谱

三、蛋白质组学的研究内容组成蛋白质组:一个细胞或组织或机体中所有蛋白质的时空表达状况的分析

功能蛋白质组:蛋白质的细胞定位、蛋白酶的活性、蛋白质与蛋白质相互作用的连锁关系及其由此实现的信号传递与调控作用四、蛋白质组研究的主要技术方法1.样品处理方法

（1）色谱（2）亚细胞分级

（3）激光解剖单细胞水平样品制备

（4）电荷分级与亲和分级（5）变性剂及表面活性剂的作用

2.二维凝胶电泳技术(2DE)

又称双向电泳,是蛋白质组学研究中的核心技术之一,是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法完整的双向凝胶电泳分析,包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDSPAGE斑点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤

Figure3.Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

⑴基本技术

原理:是在相互垂直的两个方向上,分别基于蛋白质不同的等电点和分子量,运用等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。第一向等电聚焦中使用IPG干胶条,将蛋白质成分按其等电点经分离后均匀地分布于不同的pH梯度。第一向分离后将胶条经平衡液平衡后转移至第二向SDSPAGE中进行。（3）检测方法

几个关键因素:灵敏度(检测限),线性范围,稳定性和重复性常用的检测方法主要有以下种：有机染料（最常用的是考马斯亮蓝）、银染（最常用的是碱性/二氨合银法和酸性/硝酸银法）、负染、胶体扩散染料、有机荧光团染料、金属螯合染料

（4）凝胶分离蛋白质的回收

常用的方法包括:直接提取,电洗脱,电印迹至膜上,凝胶内降解后提取的四种方法（2）2DE遇到的困难酸性和碱性蛋白质的分析,ＭＷ较小和较大的蛋白质的分析,低含量蛋白质的分析,高速度自动化,变性后分离不能反映原始状态,疏水性较强的蛋白质分析,手工操作较多、经验性强、可重复性差3.蛋白质鉴定—质谱鉴定技术

(MS)基质辅助激光解析电离质谱(MALDIMS):利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化电喷雾电离质谱(ESIMS):在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化通过测量肽段离子相关参数,如飞行时间(ＴＯＦ),即可计算得到准确的肽段质量通过稳定同位素标记,还可以用质谱进行蛋白质的定量分析。质谱技术还可以用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等4.蛋白质相互作用分析—酵母双杂交技术

分析蛋白质之间的相互作用及其方式,认识与特定生理活动相关的蛋白质网络,绘制出蛋白质相互作用的图谱(interactionmapping),是功能蛋白质组学的重要内容。酵母双杂交是一种在细胞内检测蛋白质的相互作用的技术,无需分离纯化蛋白质,是实现大规模高通量分析的主要方法

原理:真核转录因子含有两个相对独立的功能域:DNA结合(DNAbindingdomain,BD)和转录激活(activationdomain,AD)。当两者独立存在时,无转录激活功能,但两者只要相互接近,即可激活转录

存在问题：酵母双杂交技术还存在假阳性和假阴性的发生率高的问题,而且对于不能进入核内的蛋白质(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比较复杂的翻译后修饰作用的高等生物蛋白质,该技术尚不适用5.多维液相色谱-质谱技术

借助于同位素标记技术ICAT技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术(isotopecodedaffinitytags,ICAT)

可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质

ICAT的原理分别用D0和D8试剂与同种细胞的不同形态（如正常细胞和病变细胞）中的蛋白质反应，然后把两种反应产物混合在一起进行酶解，用亲和色谱分离被标记的肽段，进行MALDI-TOF测定，如一对峰相差8个质量数，则为同一种蛋白质，由D0和D8峰的相对强度进行相对定量。

存在问题：只对含半胱氨酸残基的蛋白质有效,而不能测定其它的蛋白质和多肽

6.蛋白芯片或微阵列

蛋白芯片技术的大多数是在玻璃板或膜上对蛋白或抗体进行排列缺陷：很难或不可能对翻译后修饰进行分析，而翻译后修饰对于大多数疾病又是很关键的五、蛋白质组研究中的生物信息学生物信息学已经成为当代生物学和医药学的组成部分,用于巨量生物信息资源的收集、存储、处理、搜索、共享、服务、研究和开发。由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。1.数据库各种不同类型的蛋白质数据库,是蛋白质组研究数据存储、管理的主要形式,是实现已知蛋白质的分析鉴定与未知蛋白的发现前提,也是总结蛋白质结构、性质与功能的规律,实现模拟与预测的基础⑴蛋白质氨基酸序列(sequence)数据库

常用的有PIR、SWISSPROT、TrEMBL、GenPept等。其中PIR(proteinInformationResource)和SWISSPROT是目前最常用的两大序列数据库,除序列之外,还提供已知蛋白质的功能、结构域、翻译后修饰、突变体等详尽的注释以及和其他重要相关数据库的交叉检索,是最重要的蛋白质初级数据库⑵蛋白质结构域与家族数据库

常用的有ProSite、BLOCKS、DOMO、ProDom、Profam等⑶蛋白质高级结构及分类数据库

常用的有PDB、SWISSMODEL、NRL3D、BioMagResBank、MMDB、SCOP、CATH等。其中PDB(ProteinDataBank)最为著名,收录有蛋白质原子座标、晶体结构和核磁共振的数据、一级和二级结构信息及相关文献引用⑷蛋白质2DE图谱数据库

包括SWEISSPROT2DEPAGE、SEINA2DEPAGE等综合性2DE数据库和不同生物、不同器官、组织、细胞的专一性2DE数据库⑸蛋白质相互作用数据库

常用的有ProNet、DIP、INTERACT等。除以上数据库之外,还有各种类型的专一性蛋白质数据库。上述数据库资源,均可通过访问ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem),北京大学镜像

获得链接2.工具软件

⑴蛋白质双向电泳图谱分析软件:比较知名的2DE图像分析软件有GenevaBioinformatics提供的Melanie4、美国ProteomeWorks公司的商用软件包PDQuest6.1、英国公司NonlinearDynamicsLtd.的Progenesis、德国DecodonGmbH的Delta2D等应用此类软件可完成电泳图谱背景消减与条纹消除、斑点探测、图形匹配和定量测定、数据存储与分析等一系列工作。个别功能强大的软件还具有数据统计、不同凝胶的比较、数据库联接检索、斑点注释等特殊功能⑵蛋白质鉴定工具

蛋白质的鉴定,需要利用实验得到的相关数据,通过相关的算法与程序,进行已知蛋白质数据库的搜索比对来完成。目前已有的鉴定工具,根据使用者提交的信息类型可以分为氨基酸组成比对、肽片段质量比对和部分肽段序列比对三类。常用的有AACompIdent、PeptIdent、ＳEQUEST、MultiIdent等⑶蛋白质的结构分析与功能预测工具

常见的有蛋白质翻译后修饰的预测、蛋白质序列分析与二级结构预测、蛋白质结构域预测、功能域、蛋白质跨膜区预测等各种用途的工具软件。这些工具的应用可以对蛋白质相关结构、性质与功能的实验研究,起到一定的指导参考作用六、蛋白质组在医学研究中的应用

1.疾病的蛋白质组研究

通过测定体液和组织的蛋白质组,我们可以寻找特异疾病的生物标记,即疾病特异性蛋白(diseasespecificproteins,DSPs)。DSPs水平的变化对于疾病诊断、治疗和判断愈后具有重要意义,还可以成为研究药物的药理或毒理作用的靶点。⑴肿瘤研究领域

应用DNA芯片技术实现了通过全基因组分析检测癌变过程中基因异常活化或改变,但一些与肿瘤发生发展相关的改变可能与基因水平异常无关通过比较对肿瘤细胞和正常细胞的蛋白质表达情况,可以鉴定出肿瘤特异性标记或特异性抗原,为诊断与治疗提供线索。

泌尿系统肿瘤对膀胱肿瘤细胞和尿道蛋白的大规模2D后建立了膀胱恶性肿瘤数据库,包括移行细胞癌和鳞状细胞癌的表达谱;进一步建立了膀胱癌患者尿液中分泌性蛋白的数据库

其它恶性肿瘤肝癌乳腺癌原发性肺腺癌卵巢癌白血病⑵心血管疾病研究领域

目前,已经建立了人和大鼠、狗等实验动物的心房、心室与内皮细胞的蛋白质2DE图谱的一系列数据库(http://www.expasy.ch/ch2d/2dindex.html),鉴定了数百个心血管系统特有的蛋白质。对扩张型心肌病(DCM)的系统的蛋白质组研究：发现了大约100个表达异常的蛋白质,并进行了分类。他们还将2DE与免疫标记相结合,鉴定了一些能和自身抗体发生反应的心脏特异性抗原。这些抗原与心脏移植中的急性或慢性排斥反应有关

缺血性心脏病SchwertzH等应用二维凝胶及电喷雾串联质谱分析技术研究了家兔心肌缺血再灌注（I/R）以后蛋白的表达变化，并使用一种人工丝氨酸蛋白酶抑制剂FUT-175进行干预，研究了该物质对I/R损伤的保护作用。⑶神经精神系统疾病研究领域

对精神分裂症患者以及正常人群的脑脊液进行蛋白质组学的研究。对老年痴呆症(Ａlzhermer症)的研究：通过对神经原缠结的2ＤＥ及质谱分析则发现,其主要蛋白质成份-微管相关蛋白τ(ＭＡＰτ)在疾病状态下发生了磷酸化、糖基化等多种修饰作用。2.病原微生物的蛋白质组研究

⑴确定致病菌毒力;⑵寻找新的诊断标记物;⑶为疫苗的研制寻找新的候选抗原;⑷阐明药物抗菌作用机制与病菌耐药性发生机理,为新的抗生素的研制寻找靶点

3.蛋白质组在药物开发中的应用

疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶点,另外通过翻译后修饰的蛋白质组学研究,使得新药研制获得了前所未有的契机。以ＤＳＰｓ为靶点,分析其分子结构,定向合成有效药物成为药物设计的理想模式。⑴药物靶点的发现

在病理状态下表达异常或者特异性表达的蛋白质,以及细胞信号传递通路中的关键性蛋白,都可能作为药物设计与发现的靶分子。病原微生物蛋白质组研究,也有助于了解其致病的机理和发现对药物敏感的蛋白质,为新的抗生素筛选提供更合理的靶点。⑵靶点的评价、认定与筛选的优化

通过对已知药物治疗前后病理组织的蛋白质组进行比较分析,不仅可以加快药物靶点的认定,减少后续工作的盲目性,还有助于阐明药物的分子药理,构建更为合理的筛选模型。将蛋白质组分析与组合化学的方法相结合,对结构类似物的构效关系作出比较,加速先导化合物的筛选与优化。⑶药物毒理学分析与临床前安全性评价

通过发生损伤的组织器官与正常组织器官之间的蛋白质组比较,有助于阐明药物毒副作用的发生机制。进行已知药物的毒理学蛋白质组分析,可以鉴定和积累特定组