蛋白质的修饰和表达课件2

蛋白质的修饰和表达第一节蛋白质修饰的化学途径一、功能基团的特异性修饰

I.

多位点取代

II.单一的限制性取代

III.次级取代二、基于蛋白质片段的嵌合修饰I.嵌合蛋白质—非共价缔合系统

II.二硫键与嵌合蛋白质的形成

III.嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键

IV.嵌合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键

V.通过非肽键形成嵌合蛋白质

一、功能基团的特异性修饰在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的

-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。一、功能基团的特异性修饰1．多位点取代2．单一的或限制性取代

3．次级取代

1．多位点取代(1)常规的氨基保护

(2)亚氨代乙酰基

(3)其他的侧链取代

2．限制性取代

(1)

-异硫氰酸苯酯对

-氨基的选择性(2)羰基二酰肼的亲核取代(3)蛋白醛(4)通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的

-酰胺(5)蛋白醛—由糖的化学氧化产生

3．次级取代(1)与蛋白醛偶联—亲核取代物

(2)与蛋白质活性亲核物偶联—醛取代物

二、基于蛋白质片段的嵌合修饰

通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽键(通过化学法或酶法产生)或其他非肽共价键，可以将较小的肽段连在一起，这就是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原则。二、基于蛋白质片段的嵌合修饰1．通过非共价缔合系统产生嵌合蛋白质2．二硫键与嵌合蛋白质的形成3．嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键4．融合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键5．通过非肽键形成嵌合蛋白质

第二节蛋白质改造的分子生物学途径一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.

编码基因的专一性位点突变

2.

区域性定向突变

二、基因融合和基因剪接1.

利用基因融合技术表达外源基因的缘由

2.

基因融合的策略

3.

产生蛋白质分子嵌合体的方法

4.

蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接

三、tRNA介导定点搀入非天然氨基酸基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。可以这样说，PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。

1．编码基因的专一性位点突变

专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。

(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素

(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法

(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法

①Kunkel突变法②基于抗生素抗性“回复”的突变方法③基于去除特定限制酶切位点的突变④利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变2．区域性定向突变

基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassettemutagenesis)，又称片段取代法(DNAfragmentreplacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。研究目的

通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。二、基因融合和基因剪接1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由2．基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接基因融合的用途

上述这些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。

第三节重组蛋白质的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达

一、大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。大肠杆菌表达体系的应用

当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。1．表达载体的一般特点(1)复制起始点(2)选择性基因(3)强的、可诱导的启动子(4)强的转录终止序列(5)核糖体结合位点(6)合适的多克隆位点2．与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始(2)有效的翻译(3)蛋白质水解作用(4)蛋白质的外泌3．改善表达水平的方法①诱导条件②外源基因的编码序列③用蛋白酶缺失的宿主菌4.改善外源蛋白溶解性的方法

①外源蛋白的分泌表达②细菌生长温度③外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达④外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达有关酵母表达载体的复制、转录、筛选元件

外源mRNA在酵母细胞中的翻译

3.

外源蛋白质在酵母中的分泌表达

4.

翻译后修饰二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达

1.有关酵母表达载体的复制、转录、筛选元件

2.

外源mRNA在酵母细胞中的翻译

3.

外源蛋白质在酵母中的分泌表达4.

外源蛋白质的翻译后修饰

三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达

1．选择哺乳动物细胞表达体系的优点2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统1．哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。分泌型哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处

是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表