KTB1345-CN-腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒（微量法）

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒（微量法）原理腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucosepyrophosphorylase，AGP，EC1)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。CheKine™腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒（微量法）可检测植物组织样本。在该试剂盒中，AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ3mL6mL4℃ReagentIIAPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentIIBPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·酶标仪或紫外光分光光度计（能测340nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：ExtractionBuffer有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。WorkingReagentII：临用前配制；将ReagentIIB转移至ReagentIIA瓶中，48T加入5.4mL去离子水，96T加入10.8mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentIII：临用前配制；48T加入0.8mL去离子水，96T加入1.6mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentIV：临用前配制；48T加入0.8mL去离子水，96T加入1.6mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentV：临用前配制；48T加入0.8mL去离子水，96T加入1.6mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。WorkingReagent：每孔准备35µL工作液，现配现用。按ReagentIII：ReagentIV：ReagentV=1：1：1的比例配制，混合均匀。样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。植物组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。注意：1.如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1372的测定。实验步骤酶标仪或紫外光分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。ReagentⅠ置于30℃孵育10min。操作表（下述操作在1.5mLEP管中操作）：试剂测定孔（μL）样本10ReagentⅠ50WorkingReagentII80混匀，30℃保温15min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，4,000g，4℃离心5min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：上清液80CooledReagentⅠ85WorkingReagent35充分混匀，立即记录340nm处10s时吸光值A1和130s时的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.02可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含AGP或已降解。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。AGP活性的计算使用96孔UV板测定的计算公式如下按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。AGP(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T×1.75=5,627×ΔA÷Cpr按样本鲜重计算：酶活单位定义：每克样本每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。AGP(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×1.75=5,627×ΔA÷WV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；1.75：稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d：0.5cm调整为d：1cm进行计算即可。注意事项在96孔UV板或微量石英比色皿中的操作，建议使用冷却至室温的ReagentⅠ，否则将会造成读数背景高。结果展示以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。Figure1.本试剂盒测定南瓜和玉米种子中AGP的活性。相关产品CatalogNo.ProductNameKTB1371CheKine™淀粉含量检测试剂盒（微量法）KTB1372CheKine™可溶性淀粉合成酶（SSS）