生物化学 Chapter 4 蛋白质的共价结构

Chapter4蛋白质的共价结构（Proteins）Questions:为什么每一种生物的外观形态都有差异？为什么动物可以运动？为什么食物能在较低的温度（体温）下被很快消化？为什么人体温超过40C就难以忍受？为什么说AIDS病是一种可怕的病症？Contentofchapter41.Introductionofprotein2.Peptide(Insulin)3.Primarystructureofproteinsanditsdetermination4.Aminoacidsequencesofproteinsandbiologicalfunctions5.Humansynthesisofpeptidesandproteins一、蛋白质通论

Protein—最原始的，第一重要的（一）蛋白质的化学组成和分类元素组成：

C50%H7%O23%N16%凯氏（Kjedahl）定氮法

S0-3%Othertrace单纯蛋白质(Simpleproteins)1.清蛋白(albumin)2.球蛋白(globulin)3.谷蛋白(glutelin)4.谷醇溶蛋白(prolamine)5.组蛋白(histone)--histidine6.鱼精蛋白(protamine)7.硬蛋白(scleroprotein)

缀合蛋白质(conjugatedproteins)

——辅基（prostheticgroups）或配体（ligands）1.Glycoproteins（糖蛋白）2.Lipoproteins（脂蛋白）3.Nucleoproteins（核蛋白）4.Phosphoproteins

（磷蛋白）5.Metalloproteins

（金属蛋白）6.Hemoproteins

（血红素蛋白）7.Flavoproteins

（黄素蛋白）按生物学功能分类1.Enzymes2.Regulatoryproteins3.Transportproteins4.Storageproteins5.Contractileandmotileproteins6.Structuralproteins7.Scaffoldproteins8.Protectiveandexploitiveproteins9.Exoticprotein蛋白质是生物功能的执行者。蛋白质的功能

蛋白质功能的多样性

Biologicalfunctionsofproteins（1）催化功能——酶,抗体酶；核酶（ribozyme)是核酸，而不是蛋白质；（2）

运输与储藏功能，如血红蛋白输送氧，肌红蛋白为肌肉输送氧，运铁蛋白负责在血浆中输送铁离子；跨膜蛋白主动运输；细胞色素C传递电子；卵清蛋白、酪蛋白储藏氨基酸；（3）运动功能，如肌球蛋白（myosin）和肌动蛋白（actin）引起肌肉伸缩；细菌的鞭毛或纤毛蛋白推动细胞运动；（4）免疫功能——抗体（antibody），血液凝固蛋白，毒蛋白；（5）信号传递功能——受体蛋白（receptorprotein)；（6）调控功能——细胞因子，激素；组蛋白，阻遏蛋白（repressor）；（7）建筑构件（支架）——胶原纤维蛋白，细胞膜的组成部分；（8）异常功能——乐果甜蛋白，节肢弹性蛋白，胶质蛋白。

（二）蛋白质的形状和大小（1）纤维状蛋白(fibrousproteins)（2）球状蛋白(globularproteins)（3）膜蛋白(membraneboundproteins)蛋白质的相对分子量：6000—100万Daltons1dalton=1.66X10-27kgMWofaprotein=110xNumberofA.A.Hair-keratin（角蛋白）

-keratin纤维状蛋白丝心蛋白（fibroin），如蚕丝、蜘蛛丝是一种

-角蛋白细胞色素C溶菌酶核糖核酸酶三种球状蛋白ProteinsareverylargemoleculesMolecularweight=(128-18)xNumberofresidualaminoacids

（三）蛋白质构象与

蛋白质结构的组织层次Conformation（构象）&configuration（构型）Primary—backboneSecondary—regularstructureTertiaryQuaternary(subunit)维持蛋白质结构的作用力共价键（二硫键）离子键（正电荷：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；负电荷：天冬氨酸、谷氨酸）氢键（丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、酪（lao）氨酸、色氨酸、组氨酸）疏水键（苯丙氨酸、缬(xie)氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸）范德华力（定向效应、诱导效应、分散效应）亲和力生物分子间的作用力

二、肽（Peptide）肽键

(Peptidebond)组成肽键的原子处于同一平面；大多数肽键是反式结构；只有脯氨酸参与形成的肽键可能以顺式存在。

O-C-N-H肽键平面

(或称酰胺平面，amideplane)肽与肽键氨基酸残基丙丙肽氨基端（N-端）羧基端（C-端）多肽在构造上的分类直链多肽

H-Val

H-ValH-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

H-Gly-Ala-Ser-OH

H-Gly-Ala-Cys-OH

环状多肽

-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-H-Phe-Leu-Phe-Thr-Val-Ala-Ile-

H-Cys-Tyr-Ile-Asn-Leu-Cys-Pro-OH分子量为5700daltonInsulin:chainAandchainBiscovalentlycombinantedbytwodisulfidebridges胰岛素（Insulin）

—治疗糖尿病的首选药物1921年：Banting&Macleod得到Insulin并用于临床1923年：获NobelPrize.

从动物脏器中提取。1958年：

FrederickSangerworkedoutthesequenceofaminoacidsinthepolypeptidechainsofthehormoneinsulin.Nobelprizeinchemistry.51aminoacids,twochains.Achaincontains21A.A.,Bchain30A.A.1965年：我国科学家人工合成牛结晶胰岛素；1972年：

InsulinwasproducedbyrecombinantDNAtechnology;1982onsale.胰岛素的新剂型研究：口服、鼻腔、长效缓释TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1923

------forthediscoveryofinsulinFrederickGrantBanting

JohnJamesRichardMacleod

1/2oftheprize1/2oftheprize

UniversityofTorontoToronto,Canadab.1891b.1876d.1941d.1935

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1923

------forthediscoveryofinsulin

FREDERICKSANGER1958NobelLaureateinChemistry

forhisworkonthestructureofproteins,especiallythatofinsulin.

Background

Born:August13,1918PlaceofBirth:Rendcombe,Gloucestershire,EnglandResidence:GreatBritainAffiliation:CambridgeUniversity弗雷德里克•

桑格多肽的性质(Polypeptides’properties)两性解离（pI）

多肽等电点的高低取决于侧链上的碱性和酸性基团的相对数目。多肽链的水解茚三酮反应双缩脲反应

（两个以上肽键与碱性硫酸铜）可用于多肽的定量分析(Biuret)双缩脲反应(BiuretReaction)与碱性硫酸铜作用，产生紫色或蓝紫色的铜–双缩脲络合物多肽定量测定的重要反应脑啡肽激素类多肽抗生素类多肽谷胱甘肽（GSH）毒类多肽天然活性肽谷胱甘肽（GSH－－GSSG）

还原型氧化型αβγ谷胱甘肽的合成代谢多肽药物的研究开发多肽疫苗抗肿瘤多肽抗病毒多肽

多肽导向药细胞因子模拟肽抗菌性活性肽用于心血管疾病的多肽其它药用小肽诊断用多肽已开发与应用的肽类药物神经系统神经紧张肽（NT）、催眠肽（DSIP）

内啡肽和脑啡肽的衍生物人体其他系统促甲状腺素释放激素（TRH）、生长激素（STH）

治疗糖尿病、胃溃疡、胰腺炎的多肽

DBI衍生肽（精神舒缓肽）、催产素人体的免疫系统白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）

环抱菌素、糖肽、心房肽ANP

降钙肽、抗菌肽抑制SARS病毒感染的多肽药物中国科学院微生物研究所和武汉大学生命科学院现代病毒学研究中心研制出抗击SARS病毒侵入细胞的多肽药物。第四军医大学研究人员在进行抗非典药物研究中，发现了３个对ＳＡＲＳ病毒有明确抑制作用的多肽。生命与肽肽是人体生命的反应体系活性肽---疲劳的克星活性肽---延缓衰老、推迟寿斑出现活性肽---风湿、类风湿的锌药糖尿病与活性肽活性肽与白癜风活性肽可以预防心脑血管病的发生促进矿物质吸收的肽活性肽的排毒、解酒功能活性肽---滋肝、养胃特殊身体状况的营养品纯天然鲜骨肽---二十一世纪绿色保健食品Questions1.在凯氏（Kjedahl）定氮法中：蛋白质的含量=样品中含氮量X6.25

请说明6.25的来历。2.胰岛素含51个氨基酸残基，请估算一下其大致的分子量，并简单说明理由。

三、一级结构

（Primarystructureofprotein）蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序（一）蛋白质测序的策略1.确定肽链数；2.拆分多肽链；3.断裂二硫键（过甲酸、巯基乙醇）；4.分析每一多肽链的氨基酸组成；5.分析N、C末端残基（FDNB、PITC）；6.裂解多肽链为小段肽；7.测定各肽段的氨基酸顺序；8.确定肽段的次序；9.确定二硫键的位置（对角线电泳）。（二）N-末端和C-末端

氨基酸残基的鉴定1.N-末端分析（1）二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：形成DNP-多肽，酸解后得到黄色DNP-氨基酸和游离氨基酸；（2）丹磺酰氯（DNS）法：DNS-氨基酸有荧光，灵敏度提高100倍，且不需提取；（3）苯异硫氰酸酯（PITC）法：PTH-氨基酸+剩余的肽链；（4）氨肽酶法：亮氨酸氨肽酶（LAP）。2.C-末端分析（1）肼解法：与肼反应生成氨基酸酰肼，再与苯甲醛作用形成不溶于水的二苯基衍生物沉淀，C-端氨基酸游离于水相。（2）还原法：用硼氢化锂将氨基酸还原成相应的

-氨基醇；（3）羧肽酶法：羧肽酶A和B混合使用，羧肽酶Y可单独使用。蛋白质氨基酸顺序的分析：

多肽链选择性降解——酶解法Sequenceofaminoacids二硝基氟苯

DNFBor苯异硫氰酸酯

PITC丹磺酰氯

DNS6M苯乙内酰硫脲（三）二硫桥的断裂过甲酸氧化法巯基化合物还原法例:巯基乙醇(pH8-9)+8M尿素或6M盐酸胍处理,使S-S键还原为-SH,再用碘乙酸保护P172图4-8NHH2N-C-NH2HCl(盐酸胍)（四）氨基酸

组成的分析6MHCl于110C下真空水解10-24小时,Trp被破坏;Ser,Thr,Tyr部分破坏;Asn,Gln水解成Asp,Glu;5MNaOH水解20h,可以定量Trp;甲基磺酸代替盐酸水解蛋白质（五)多肽链的部分裂解

和肽段的分离纯化1.酶裂解法(内肽酶—endopeptidases)(1)胰蛋白酶(trypsin)(2)糜蛋白酶(chymotrypsin)(3)嗜热菌蛋白酶(thermolysin)(4)胃蛋白酶(pepsin)(5)木瓜蛋白酶(papain)(6)葡萄球菌蛋白酶(Staphylococcalprotease)(7)梭菌蛋白酶(clostripain)蛋白质氨基酸顺序的分析：

多肽链选择性降解——酶解法蛋白质氨基酸顺序的分析2.化学裂解法：(1)溴化氰(Cyanogenbromide)水解法：其选择性的切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键(P175)。(2)羟胺断裂:NH2OH在pH9下断裂Asn-Gly肽键.(六)肽段氨基酸序列测定1.Edman化学降解法(P176)：能够重复循环，将肽链N-端氨基酸逐个进行标记和解离，可检测<100个氨基酸残基。2.酶降解法：用外肽酶(exopeptidases)，只能测定末端附近几个氨基酸残基。3.质谱法：电喷射电离串联质谱仪（P178，图4-11）；4.根据核苷酸序列推定法：抗原蛋白抗体多核糖体mRNAcDNAA.A.sequencePTC苯异硫氰酸酯(七)肽段在多肽链中次序的决定重叠肽(overlapingpeptide)两种以上的断裂多肽的方式确定多肽链的氨基酸序列例：P179(八)二硫桥位置的确定胃蛋白酶水解对角线电泳(diagonalelectrophoresis)两次电泳间隙用过甲酸蒸汽熏蒸（九）蛋白质测序举例牛胰岛素(bovineinsulin):1953年Sanger等人完成ChainA=21A.A.residues;ChainB=30A.A.residues;2S-Sbondinterchain;oneintrachain（十）蛋白质序列数据库PIR(/pir/)SWISS-PROT(http://www.expasy.ch/sprot/)GenBank(/Web/Genbank/)(Medline)EMBL(http://www.ebi.ac.uk/embl.html)四、肽和蛋白质的人工合成牛胰岛素舒缓激肽牛胰核糖核酸酶催产素四、多肽的化学合成多肽的合成历史：第一兴盛时期：

1907年Fischer合成18肽Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)9

第二兴盛时期：

1932年Bergmann开发了氨基的保护基第三兴盛时期：

1950年左右合成天然生理活性多肽以上合成采用的是液相合成法

1963年：Merrifield开发了固相合成法,合成(Leu-Ala-Gly-Val)。多肽的化学合成CH2COOH(CH2)4NH2H2N–C—COOHH2N—C—COOHHH

Asp

Lys

如果让上面两个氨基酸合成，其结果如何？多肽的化学合成

要成功地合成具有特定氨基酸顺序的多肽,必须采用定向形成酰胺键方法，即对暂时不参与形成酰胺键的氨基和羧基以及侧链活性基团加以保护。多肽的化学合成氨基保护法：能够在温和条件下酰化及去酰基化最常用的两大保护方式：Boc

化学和Fmoc

化学1)叔丁氧基酰基(t-Boc-或Boc-)：Boc-AA-OH

去保护基：CF3COOH(TFA)2)Fmoc-AA-OH:

去保护基：哌啶3)苄氧酰基(CBz-或Z-)：Z-AA-OH

去保护基：催化氢解（H2/Pd）多肽的化学合成羧基保护法：酯化方法进行保护1)苯甲醇酯法(-OBzl)：去保护基：氢解（H2/Pd）方法。2)叔丁醇酯法(-OBut

)：

去保护基：TFA多肽的化学合成肽键形成方法1)羧基活化法

酰氯法(易产生氨基酸消旋化)；酸酐法(易产生氨基酸消旋化)；活化酯法（常用的是氨基酸对硝基苯酚酯）2)偶联剂缩合法

常用的偶联剂是N,N’-二环已基碳二亚胺(DCC).

此法的优点是消旋化的可能性很小。

方法：此法的基本过程：是将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一个氨基酸羧基作用(用DCC作偶联剂)形成肽键。不断重复这一过程，即可得到目标多肽的产物。solid-phasepeptidesynthesis(SPPS)多肽的固相合成法优点：合成效率的提高（简单的洗滤操作--繁琐的分离、重结晶、层析）；促进了生命科学的发展；促成了自动合成仪及组合化学的问世。

TheNobelPrizeinChemistry1984

forhisdevelopmentofmethodologyforchemicalsynthesisonasolidmatrixRobertBruceMerrifield

USARockefellerUniversity

NewYork,NY,USAb.1921=树脂AA=Aminoacid保护基—AA1—去除保护基(TFA)多肽链的伸长去除保护基去除树脂Solid-PhaseSynthesisofPolypeptide缩合(DCC)保护基—AA2—OR

（活性酯）

保护基—AA1—OH+(risen)(Boc)+H3N—AA1—缩合保护基—AA2—AA1—保护基—AAn—AAn-1……AA2—AA1—+H3N—AAn—AAn-1……AA2—AA1—OHABI433A型多肽自动合成仪

液相合成

固相合成多肽的化学合成多肽的化学合成组合法合成多肽概念：巧妙的应用合成策略和程序，从某种单体或单元出发，快速合成大量的寡聚物异构体，并进行生物活性筛选。（xn）组合化学法合成多肽

均分合成法每一个合成步骤分别合成x组中间体，将这些中间体混合均匀后平均分成x份，并分别延长一个结构单元。反应产物再混合均匀分成x份，在延长下一个结构单元，直至完成全部合成。五