05核酸化学2省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

第五章核酸化学NucleicAcidNA第1页四DNA结构一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列次序。二级结构：DNA两条多聚核苷酸链间经过氢键形成双螺旋结构。三级结构：DNA双链深入折叠卷曲形成构象。第2页（一）DNA一级结构蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸★DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP经过3’、5’-磷酸二酯键连接起来线形或环形多聚体。

第3页核苷酸之间连接方式：3’,5’-磷酸二酯键第4页书写方式pTpGpCpApTpTGCAT5’→3’，不可颠倒第5页(二)DNA二级结构1953年，Watson&CrickDNA双螺旋结构模型第6页★Chargaff规律1950年a.全部生物DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T;b.DNA碱基组成含有种特异性;c.DNA碱基组成没有组织和器官特异性;d.年纪、营养情况、环境等原因不影响DNA碱基组成。第7页★DNANa盐纤维和DNA晶体X光衍射分析Franklin第8页1两条多核苷酸链绕同一个轴形成右手双螺旋，螺旋直径2.0nm。而且两条多核苷酸链是反向平行。第9页2糖-磷酸骨架位于双螺旋外侧，碱基位于链内部。糖平面与螺旋中心轴平行，碱基平面与轴垂直。双螺旋表面有两个宽度不一样沟槽，称大沟和小沟。第10页3相邻碱基对间轴向距离0.34nm，螺旋轴距3.4nm，10个核苷酸形成一圈螺旋。第11页4双螺旋两条链之间按照A与T，C与G碱基配对标准互补配对(称Watson-Crick配对)，而且AT之间形成两个氢键，CG之间形成三个氢键第12页5维持双螺旋结构稳定作用力

碱基堆积力(最主要)，包含碱基对芳香环堆积所产生疏水作用力和堆积碱基对间范德华力两条多核苷酸链互补碱基对间氢键磷酸基团上负电荷与溶液中阳离子间盐键第13页（1）

B—DNA：经典Watson-Crick双螺旋DNA右手双螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺距：3.32nm（2）

A-DNA右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子含有这种结构。（3）Z-DNA左手螺旋，外形细长。天然B-DNA局部区域能够形成Z-DNA。DNA双螺旋其它形式第14页第15页第16页（4）

三股螺旋DNAK.Hoogsteen1963通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋大沟结合：Oligo(Py):Oligo(Pu)—Oligo(Py/Pu)第17页★第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股能够是寡嘧啶或寡嘌呤第18页T=A:A,C≡G：C+T=A:TC≡G：G三股螺旋DNA中Hoogsteen-bonding★第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对第19页★当DNA一段寡嘧啶（寡嘌呤）组成镜像重复时能够形成三股螺旋（铰链DNA，hingedDNA,H-DNA)H-DNA结构第20页★DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组起始位点或调整位点，如开启子区。第三股链存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏相关遗传信息表示。第21页(三)DNA三级结构（1）松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）正超螺旋与负超螺旋DNA第22页第23页第24页共价闭合环状DNA，超螺旋DNA超螺旋是指螺旋轴本身扭曲，假如DNA双螺旋轴没有扭曲，则为松弛型(relaxedform)。若松弛型环状DNA分子一条链断裂，绕另一条完整链以解链方向(左手)旋转几圈，当末端重新连接起来时，因为DNA双螺旋旋转不足而会造成局部解链结构，或者经过增加每个螺旋碱基数来解除它旋转不足。这种因欠旋而产生张力将驱使DNA形成超螺旋(负超螺旋)。一样，若DNA双螺旋旋转过分会造成正超螺旋。全部天然DNA超螺旋都是负超螺旋。第25页DNA拓扑学性质L：连环数(linkingnumber)，指两条链相互缠绕次数。共价闭合环状DNA两条链都不停裂，则不会改变。T：盘绕数(twistnumber)，指螺旋圈数。W：超螺旋数(writhingnumber)，指DNA超螺旋绕螺旋轴次数。

L＝T＋W一给定环状DNA分子(L不变)因拓扑学性质而产生不一样形式，如松弛型和超螺旋型，称拓扑异构体。结构相同、L值不一样DNA分子称为拓扑异构体。第26页真核生物染色体DNA(线形双螺旋结构)在核小体中扭曲也是一个超螺旋DNA负超螺旋有利于DNA复制及转录时双螺旋打开第27页真核细胞染色体DNA特点重复序列高度重复序列在基因组中出现几千～几百万次，如卫星DNA。人染色体中约占20％。不被转录中度重复序列十几～几百次。人约占12％。有些作为基因，如rRNA与tRNA基因，组蛋白基因，免疫球蛋白基因。有些是非转录区，与基因表示调控相关。轻度重复序列与单一序列绝大多数蛋白质基因原核生物中重复序列极少存在第28页回文结构，反向重复，180度旋转对称第29页基因中插入序列真核生物基因中存在非编码序列，称插入序列。基因编码区称外显子(exon)，其间插入序列称内含子(intron)第30页五RNA结构tRNA结构分子量约25000，4S。60～95个核苷酸，多数为76个。约有15个位置碱基是不变，约8个位置半不变。3’端CCA，为接收氨基酸位置。反密码子能识别mRNA密码子含有较多修饰成份。第31页tRNA二级结构：

三叶草形第32页tRNA三级结构：

倒L形第33页真核生物mRNA结构5’-帽子

m7G经过特殊5’,5’-三磷酸连接。与翻译起始相关，并可预防5’-核酸外切酶水解原核生物无帽子结构5’-帽子5’-非编码区编码区3’-非编码区polyA第34页Poly(A)尾巴真核生物成熟mRNA3’-端有一段长100～200个腺苷酸Poly(A)尾巴，Poly(A)可提升mRNA稳定性。可用Oligo(dT)接在纤维素上，作成亲和层析柱来纯化真核生物mRNA。第35页六核酸性质和惯用研究方法普通性质DNA分子量106～1010白色纤维状晶体RNA分子量104～106白色粉末或晶体第36页DNA在碱中稳定RNA在碱中易分解酸性溶液中糖苷键易断裂第37页核酸紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm紫外波段有强烈光吸收λmax=260nm第38页1、判定纯度纯DNAA260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNAA260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值显著降低。2、含量计算1ABS值相当于：50µg/mL双螺旋DNA或：40g/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判断DNA是否变性在DNA变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）第39页紫外吸收(260nm)E(p)克原子磷消光系数每升含1摩尔磷核酸溶液在一定pH(pH=7)，一定波长(260nm)，光径为1cm时光吸收值DNA：E(p)6000～8000RNA：E(p)7000～10000第40页增色效应：核酸变性或降解后，其碱基暴露使E(p)值增高减色效应：变性核酸复性后其紫外吸收强度或E(p)值下降第41页沉降不一样介质密度梯度超离心DNA氯化铯RNA蔗糖可得到浮力密度，G＋C含量以及分离核酸第42页浮力密度测定密度梯度沉降平衡测出核酸密度用已知密度DNA作参考，离心测rρ＝ρo＋4.2ω2(r2-ro2)×10-10(g/cm3)第43页DNA中G-C含量测定ρ∝(G+C)%ρ=0.100(G+C)%+1.658(g/cm3)第44页第45页核酸分离和核酸构象测定浮力密度RNA＞环状DNA环状DNA＞线状DNA＞蛋白质单链DNA＞双链DNA石蜡油蛋白质开环及线性DNA质粒DNARNA染料-CsCl密度梯度超离心分离质粒DNA及各种杂质第46页核酸变性、复性和杂交变性(denaturation)指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链紫外吸收增高、粘度降低、浮力密度升高、生物活性降低或消失第47页变性DNA变性过程★核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，不包括共价键断裂。第48页

★变性原因：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

★变性后理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。第49页★

增色效应与减色效应增色效应：在DNA变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA复性过程中，摩尔吸光系数减小。★DNA变性是暴发式，变性作用发生在一个很窄温度范围内。第50页Tm(meltingtemperature)熔点或熔解温度E(p)最大改变值1/2时温度，或DNA双螺旋结构失去二分之一时温度影响原因DNA均一性均一性越高，熔点越高G-C含量：成正比Tm=69.3+0.41×G-C%介质中离子强度越高熔点越高第51页1、

熔解温度（Tm）：★DNA双螺旋结构失去二分之一时对应温度。浓度50µg/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值二分之一时，即1.185时，对应温度即为Tm。DNATm普通在82—95℃之间第52页2、

影响DNATm值原因①DNA均一性。均一性高，变性温度范围越窄，据此可分析DNA均一性。第53页②G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44Tm值与GC含量关系第54页③介质中离子强度离子强度高，Tm高。第55页复性(renaturation)变性DNA在适当条件下，两条彼此分开链重新缔合成为双螺旋结构

物化性质、生物活性恢复影响原因DNA浓度和均一性浓度越高，越均一，复性越快温度维持在比Tm低25℃最正确。骤然冷却，不能复性DNA分子量和DNA复杂程度分子量越大，越复杂，复性越慢离子强度增加盐浓度，复性加紧第56页★复性机制：10-20bp成拉链★热变性DNA在迟缓冷却时能够复性，快速冷却不能复性。★DNA片段越大，复性越慢；★DNA浓度越大，复性越快。★复性速度可用Co·t衡量。Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。第57页不一样DNA复性动力学曲线第58页●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒●E.coli4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0umol/L，则复性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，约115天。复性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，5758天。●依据复性动力学能够测定基因组大小和重复序列拷贝数第59页杂交(hybridization)两种起源不一样含有互补碱基序列多核苷酸在溶液冷却时形成双螺旋结构SouthernblottingDNA-DNANorthernblottingDNA-RNA第60页1、

SouthernBlottingDNA样品→酶切→电泳→碱变性→转膜→固定→杂交→洗涤→放射自显影变性（NaOH0.5mol/L）转膜（NC膜，尼龙膜）固定（80℃，4-6h）杂交（高盐浓度，68℃，几小时）SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列大小和定位。第61页第62页第63页SouthernblottingDNA琼脂糖电泳，碱变性印迹转移与探针杂交

探针为同位素标识