（高清版）DB37∕T 2038-2012 牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)分子检测技术规程　

DB37DB37/T2038—2012牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程Technicalspecificationofdetectionfordeficiencyofuridinemonophophatesynthaseinbovine2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布I1GB/T6682-2008分析实验室用NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子尿苷酸合酶缺乏症deficiencyofuridinemonoph尿甘酸合酶缺乏症是由于牛体内尿苷酸合酶（UridineMonophophateSynthase，UMPS）基因的C-DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribo2尿甘酸合酶缺乏症是由于奶牛体内尿苷酸合酶（UMPS）基因的C-末端405处的密码子存在一个点突胚胎早期死亡。基于这个点突变设计引物对该区域进行PCR扩增以及RFLP分析，由于野生型与突变型个除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的双蒸水下游引物：5'-GCTTCTAACTGAACTCCT3DB37/T2038—200.5μL,10pmol/μL的上、下游引物各0.5μL,TaqDNA聚合酶1U,DNA模板100ng,加双蒸水至208.5.2PCR扩增循环参数8.5.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测再用1×TAE冲洗一次，水平放置。称取溶液澄清透明，室温下冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭并混匀，使其终浓度为0.5μg/mL,即得1%8.6RFLP分析8.6.1RFLP酶切体系10μL酶切体系：PCR产物1.0μL,限制性内切酶AVaI(10U/μL)0.3μL,10×Buffer1μL,超纯水8.7μL,37℃水浴消化过夜。9.1PCR扩增产物检测扩增产物大小为95bp,条带清晰(见图1),可进行下一步检测。图1UMPS基因PCR扩增结果(DL2000DNAMaker)4子(-/+),如图2(另有21bp酶切片段由于片段较小，电泳中没有显示)。M-1--1--/+-1--1--/+-1-M-1--1--/+-1--1--/+-1-图2酶切产物SDS电泳结果(50bpDNALander)5主要仪器设备A.2单道可调移液器：2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000A.5恒温振荡器：0r/min～200r/min，0℃~60℃6称取SDS2g，加超纯水18mL，加热至68℃助溶，B.60.5mol/LEDTA(10mmol/LTris·Cl（pH8.0）、07﹪（B.1730﹪丙烯酰胺（49：1）丙烯酰胺147g和N，N′-亚甲双丙烯酰胺3g溶解于400mL水中，将溶液加热至37℃溶解，完全溶解后89C.7加入1mL75﹪的冰乙醇（-20℃)洗涤DNA沉淀2次，12000rpm、4℃离心3min。D.3加入等体积酚:氯仿:异戊醇(D.5取上清，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃),沉淀DNA，12000rpm、4℃离心2min。D.6加入1ml75%的冰乙醇（-20℃)洗涤DNA2次。立即插入相应的点样梳，将胶板水平放置，室温静置20-60min以待