DB32T3487-2018黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程

ICS65.020.20

B16

备案号：60524-2018DB32

江苏省地方标准

DB32/T3487—2018

黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程

TechnicalSpecificationfortheSeedlingDetectionofCucumberGreenMottle

MosaicVirus

2018-11-09发布2018-11-30实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T3487—2018

黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程

1范围

本标准规定了苗床期瓜苗黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测条件、检测技术、结果判定和结果记载。

本标准适用于苗床期症状尚未表现的瓜类作物上黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的的修改单）适用于本文件。

GB/T35335黄瓜绿斑驳花叶病毒病监测规范

SN/T2964植物病毒检测规范

3检测条件

3.1主要试剂

磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钾（KCl）、氢氧化钠（NaOH）、碳酸氢二

钠（Na2HCO3）、氯化钠（NaCl）、叠氮化钠（NaN3）、PVP-400、鸡卵清蛋白、无水亚硫酸钠（Na2SO3）、

吐温-20、焦碳酸二乙酯（DEPC）、溴百里酚蓝、乙二醇、Tris碱、Tris-HCl、硼酸、EDTA、无水乙醇、

琼脂糖、DIGDNALabelingKit、CGMMV抗体。PCR试剂和检测过程中所需溶液配方，参见附录A。

除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。

3.2用具及仪器

用具耗材：移液器、一次性手套、牛皮纸袋、标签纸、记号笔等

仪器设备：高压灭菌锅、培养箱、高速冷冻离心机（规格：-6℃~20℃、最高转速12000转/分以上）、

电泳仪（规格：电压50~120V、电流10~800mA）、PCR仪、凝胶成像系统、超纯水仪。

4检测技术

4.1采样方法

4.1.1采样时间

待检材料为嫁接或未嫁接的黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜类作物幼苗，采样时间为出厂定植前3

天~7天植株处于2片~4片真叶期。

4.1.2采样部位

植株最上部半展开-展开的心叶，心叶未达要求时取位于心叶下部一张完全展开叶。

4.1.3取样方法

五点法取样，一株为一个样本，不同品种或同一品种不同时间播种的为不同批次，每批次样本数量

不小于200株或同批次苗的0.1%。样本采集时使用一次性手套单株采集并临时保存在一次性手套中。

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4.1.4样品处置

取样后叶片一分为二，一半为检测样品、一半为留存样品。样品用吸水纸包裹置于透气牛皮纸袋中，

新鲜检测样品在4℃下临时保存3天内检测完毕，如不能在3天内检测则将样品于-20℃的条件下冰冻

保存。留存样品室温下荫干-20℃的条件下冰冻保存一年后，确认不再需要时焚烧或深埋处置。

4.2检测方法

4.2.1样品处理

称取0.1g待检样品叶片，加入适量液氮充分研磨成粉末后加入10倍体积的通用样品处理缓冲液（见

附录A）溶解，10000转/分离心5分钟，上清即为样品提取液。同一批样品中加入具典型斑驳花叶症状

并经PCR法鉴定确认为CGMMV的病样稀释1000倍为阳性对照、经PCR法确认无CGMMV的健康

叶片为阴性对照。

4.2.2免疫捕获

4.2.2.1用碳酸盐包被缓冲液（见附录A）稀释黄瓜绿斑驳花叶病毒的抗血清500倍，取稀释后的抗血

清30μL包被PCR管，4℃孵育过夜或37℃下放置2h。

4.2.2.2弃包被缓冲液，用洗涤缓冲液（见附录A）洗涤3次~4次，加入50μL样品提取液，37℃孵育

2h。

4.2.2.3弃样品提取液，用洗涤缓冲液洗涤3次~4次，再用无菌去离子水洗一次，吸尽管底余液后直接

在包被了病毒的PCR管中进行反转录。

4.2.3反转录

4.2.3.1CGMMV特异性引物的设计及合成根据CGMMV分离物（Genbank序列号DQ217778）序列

设计一对用于扩增CGMMV-cp基因的特异性引物：F:5′-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3′；R:5′-

TGGGCCCCTACCCGGGGAAAAG-3′，-20℃保存。

4.2.3.2反转录体系及操作在免疫捕获后的CR管中加入CGMMV3’端引物1μL，DEPC水9μL，

65℃变性5min，取出置于冰上5min，再依次加入下列试剂：5×M-MuLV反转录酶缓冲液2μL，40

mmol/LdNTPs（每种10mmol/L）0.5μL，RNasin（40U/μL）0.5μL，M-MuLV反转录酶（20U/μL）

0.5μL，42℃水浴1h，70℃灭活10min，-20℃保存备用。

管，参照NY/T2288-2012中7.4的要求进行，并略有改进。

具体操作参见附录B。

4.2.4PCR

以反转录合成的cDNA第一条链为模板，进行PCR扩增，扩增反应体系25μL。

25μLPCR标准反应体系：10×TaqPCRBuffer(WithMg2+)2.5μL，40mmol/LdNTPs（每种10

mmol/L）0.5μL，TaqDNAPolymerase(5u/ul)0.5μL，CGMMV上游引物（10μmol/L）0.5μL，CGMMV

下游引物（10μmol/L）0.5μL，cDNA3μL和DEPC水17.5μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min，循环30次；

72℃延伸10min。

上述PCR结束后，每个PCR管中取出1μL加入新PCR管中，采用同样的25μLPCR标准反应体

系和PCR反应程序再次进行PCR扩增。

5结果判定

7.1电泳检测

配制1%琼脂糖凝胶，将PCR产物3μL与上样缓冲液3μL混合加入样品孔中，100V电泳30分钟。

核酸染料染色15min，凝胶成像系统拍照观察。

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7.2结果判定

观察琼脂糖凝胶电泳（参见附录B）结果，阳性对照在660bp处有条带出现，且阴性对照无条带

出现的前提下，待测样品在660bp处有条带出现，即可判定样品携带CGMMV；否则为阴性反应，即

样品不携带CGMMV。

当样品检测为阳性时，按GB/T35335规定执行。

8结果记载

将实验室检测鉴定结果记载于表1（瓜苗携带黄瓜绿斑驳花叶病毒检测结果记录表）（见附录B），

记录保存1年以上。

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附录A

(资料性附录)

试剂及配制方法

A.1免疫捕获缓冲液

A.1.1洗涤缓冲液（WashBuffer,0.01MPBST)

称取8gNaCl、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、3gNa2HPO4溶化于800mL无菌去离子水中，再加入

0.5mLTween-20定溶于1000mL，即为0.01MPBST，4℃保存。

A.1.2通用样品处理缓冲液（GeneralExtractBuffer）

称取2g鸡卵清蛋白，1.3g无水亚硫酸钠，20gPVP-400和0.2g叠氮化钠，加入1000mLA.1.1

所述0.01MPBST中，再加入10mLTween-20，4℃保存。

A.1.3碳酸盐包被缓冲液（Coatingbuffer,0.5M)

称取1.59g无水Na2CO3和2.93gNaHCO3，加水定容至1000mL，用HCl调节pH值至9.6，4℃保存。

A.2RT-PCR试剂

A.2.1RT-PCR分子试剂

TaqDNA聚合酶、dNTP、购自大连宝生物公司。反转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂购自Promega

公司，-70℃保存。

A.2.2电泳缓冲液TBE

在1000mL去离子水中加入Tris碱54g、硼酸27.5g、20mL0.5MEDTA（pH8.0），使用时利用去

离子水10倍稀释，即为0.5×TBE。

A.2.3琼脂糖凝胶

在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的琼脂糖，融化，冷却至60℃倒入插入梳子的制胶槽中，冷却

凝固后点样电泳。

A.2.4上样缓冲液

取溴百里酚蓝0.025g，乙二醇3g，加10mL蒸馏水。

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附录B

(资料性附录)

检测结果记载表

表1瓜苗携带黄瓜绿斑驳花叶病毒检测结果记录表

第一次PCR结果第二次PCR结果

样品采集样品采集样品种类测定样品

阳性样品阴性样品带毒株率阳性样品阴性样品带毒株率鉴定技术负责人

日期地点与名称数量（株）

数（株）数（株）(%)数（株）数（株）(%)