全国省级结核病防治机构新员工培训-赵冰

结核病实验室生物安全及细菌学检查2017全国省级结核病防治机构新员工培训班北京国家结核病参比实验室赵冰实验室生物安全与生物材料一起安全地工作!2025/2/10什么是生物危害？指对活的有机体的健康，主要是对人类的健康造成威胁的生物学物质。生物危险包括医学废物或微生物标本、病毒或（来自生物源的）毒素，影响人类健康或对动物产生危害。什么是生物安全?有关感染性微生物污染和危险生物材料的安全操作三者互相影响

工作人员

实验室

标本20世纪50-60年代生物安全实验室出现在美国；1983年WHO《实验室生物安全手册》，2004年第三版。相关的文件法规1987年第一个生物三级实验室中华人民共和国传染病防治法（2004)国务院424号令：《病原微生物实验室生物安全管理条例》

《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）《人间传染的病原微生物名录》(2006.01.11)国家对病原微生物实行分类管理

国家根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类：第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。第三类病原微生物，是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。第四类病原微生物，是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。其中，第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。生物安全与污染的相互关系设计与设施设备（安全与其他）操作规则（标准的及微生物专业操作）9操作规则消除或最小化生物危害专门的实验室设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范最重要的概念：进入规定个人防护操作程序实验室工作区域生物安全管理10基本的生物安全设备生物安全柜生物安全离心机高压灭菌器紫外灯11实验室设计和设施在设计实验室和安排某些类型的实验工作时，对于那些可能造成安全问题的情况要加以特别关注:

…………气溶胶的形成处理大容量和∕或高浓度微生物仪器设备过度拥挤和过多啮齿动物和节肢动物的侵扰未经允许人员进入实验室标本和试剂的工作流程对实验室实行分级管理国家根据实验室对病原微生物的生物安全防护水平，并依照实验室生物安全国家标准的规定，将实验室分为一级、二级、三级、四级。13一级生物安全水平实验室基础–一级生物安全水平基础的教学、研究 GMT 开放实验台14二级生物安全水平实验室基础–二级生物安全水平

初级卫生服务；诊断、研究GMT+加防护服、生物危害标志 开放实验台，此外需生物安全柜用于防护可能生成的气溶胶15三级生物安全水平实验室防护–三级生物安全水平

特殊的诊断、研究 在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流生物安全柜和／或其他所有实验室工作所需要的基本设备16四级生物安全水平实验室最高防护–四级生物安全水平 危险病原体 在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理Ⅲ级生物安全柜或Ⅱ级生物安全柜并穿着正压防护服、双开高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气Hi，我们不是宇航员结核病实验室的细菌学检查

涂片、培养和药敏18

结核菌是由德国科学家科赫于1882年发现的。历史条件：19世纪80年代是细菌学的全盛时代。当时，用染片方法找病原菌方面已有德国病理学家魏格特的美兰法，又有德国科学家欧利希德加热固定法。发现结核菌的技术条件已成熟。早期历史简介目的：诊断传染性结核病监控治疗效果确定完成治疗为流行病学疫情评价服务涂阳患病率、涂阳发病率意义：痰涂片显微镜检查是诊断传染性结核病的最有效手段之一痰涂片显微镜检查阳性的患者比阴性患者的传染性高出10倍以上。准确的实验室诊断对于挽救病人生命、改善公众健康非常重要。痰涂片显微镜检查的目的和意义

20六、痰涂片检查对象

确定诊断：就诊及转诊的结核病可疑症状者（即时痰、夜间痰、晨痰）疗效评价：初治涂阳患者在疗程满2、5、6月时，复治涂阳患者在疗程满2、5、8月时，按期送检两份痰（晨痰、夜间痰）初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在治疗第3个月末增加痰涂片检查1次。确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2个月和6个月时进行痰菌检查。抗酸菌非抗酸菌碱性复红加热

Z－N染色的原理

细胞壁脂质复合物抗酸菌非抗酸菌碱性复红脱色Z－N染色原理－4复染24萋尼氏染色镜下形态25荧光染色镜下形态抗酸杆菌阴性、抗酸杆菌阳性1+….4+。我国绝大多数实验室使用的结核菌实验室诊断技术。公共卫生领域很有优势的技术（简单、快速、价格低廉需要设备简单等）。检测很少量标本:0.01-0.1ml。检出率低（需要标本中含较多菌才能检测到，理论上标本中每毫升至少需5000－10000个抗酸菌/ml），同时也提示只要涂片阳性，则痰中菌量很大。荧光法敏感度增加（约10%），读片时间需要更短。萋尼氏染色法特异性较高，例如荧光染色法不能确定的涂片，以及分离培养物（罗氏培养物、液体培养物）均需经萋尼氏染色法进行确定。

涂片染色镜检特点分枝杆菌培养和菌种鉴定2728为什么进行培养对痰涂片阴性的病人进行诊断获得药敏试验所需的纯培养物-MDR诊断：是获得药敏试验所需纯培养物的前提和基础疗效判断：是评价治疗效果的重要指标结核分枝杆菌的生长要求：

兼性需氧菌最适生长温度为37℃

最适PH为6.5～7.2

营养要求：氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）、生长因子生长缓慢：在一般培养基上分裂一代需要10多小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。29如何进行培养固体培养-简单法，中和离心法液体培养-中和离心法30标本的选择标本－3涂2培原则3份痰标本均为阳性：选取阳性级别高的2份痰标本进行培养；3份痰标本2份阳性：选取2份阳性痰标本进行培养；3份痰标本1份阳性：选取阳性标本和1份质量好的阴性标本进行培养3份痰标本均为阴性：选取2份质量好的阴性标本进行培养。31痰标本1－2倍4%

NaOH振荡匀化静置15分钟均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时37℃竖直培养8周32分枝杆菌培养阳性33阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物液体培养基改良Middlebrook7H9培养基上部空间已预先充填10%CO2

BACTEC™MGIT™960操作系统

液体培养优势分枝杆菌生长更好比固体培养基的阳性率更高(15-30%)对非肺部样本,其检出率更高对涂片阴性样本,其检出率更高适用于更多种类的分枝杆菌生长报告时间更快(12-14天)更好和更快的药敏试验结果(4-13天)生化对硝基苯甲酸（PNB），噻吩-2-羧酸肼（TCH），耐热触媒，硝酸还原，烟酸生成。。。分子生物学测序，PCR，线性探针，基因芯片，质谱，基因探针。。。其他免疫学方法分枝杆菌酸抗结核药物敏感性试验

药敏试验的目的1.科学研究目的了解化疗的机制,研究治疗成功与失败的原因2.流行病学研究某一时间某一地点原发耐药/获得性耐药的流行情况3.制定大范围治疗结核病患者的计划估算全敏感的患者数量4.为患者制定个体化的治疗方案诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案）基本原理耐药的产生耐药是细菌群体的一种基本的现象。对于空洞型肺结核病患者，在开放性空洞中细菌的含量可达107-109，而干酪样坏死病变中细菌含量一般不超过102-104。结核分枝杆菌存在自发的突变，每代每个细菌对以下药物的平均突变概率分别为：

INH：3×10-8，

SM：3×10-8，

EMB：1×10-7，

RMP：2×10-10，

理论上对两种药物同时耐药的突变概率为10-15。耐药的产生根据广泛认同的理论，耐药的产生是由于在治疗过程中对患者体内已存在的耐药突变菌选择和增殖的结果。在应用链霉素治疗结核病的过程中发现耐药现象的产生。如果单独给予链霉素，开始时患者的症状迅速改善，痰菌减少；但随后患者的症状恶化，痰菌增多，表现出耐药，患者的分离菌株可以在含链霉素的培养基上生长。对照培养基(drug-free)含药培养基所有菌落均生长仅耐药菌生长药敏试验方法世界卫生组织推荐的药敏试验方法基于生长观察：固体培养方法比例法绝对浓度法抗性比率法基于生长检测（产生二氧化碳、消耗氧气等）液体药敏法基于基因突变检测探针杂交、测序等方法

中国疾控中心结控中心国家结核病参比实验室2013年全国结核病耐药监测NationalSurveyofDrug-resistantTuberculosisinChina（2013）2013年结核病监测基本情况监测点：70个；抽样方法：分层整群随机抽样；监测时间：2013年1月1日-12月31日；监测对象：诊断为活动性结核病的初、复治患者；最低样本含量：初治S+：3000初治S-C+：748复治S+：527患者纳入情况应纳入初治涂阳患者3000人，实际纳入4628人；应纳入初治涂阴培阳患者748人，实际纳入1912人；合计纳入初治患者6540例；应纳入复治涂阳患者527人，实际纳入758人