《山药种薯（苗）病毒RT-PCR检测技术规程》

1DB36/XXXXX—XXXX山药种薯（苗）病毒RT-PCR检测技术规程本标准规定了山药种薯（苗）病毒RT-PCR检测技术的术语和定义、检测对象、抽样、RT-PCR检测方法、种薯（苗）质量标准等。本标准适用于山药种薯（块茎、零余子）、种苗病毒的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T402脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程NY/T1212马铃薯脱毒种薯繁育技术规程SN/T2964植物病毒检测规范SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1反转录PCRReversetranscriptionPCR指一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。3.2带毒率Virus-carryingrate指各级别山药种薯（苗）受病毒侵染薯块（植株）比率。4检测对象中国淮山药坏死花叶病毒（Chineseyamnecrosismosaicvirus，简称CHYNMV）日本淮山药花叶病毒（Japaneseyammosaicvirus，简称JYMV）2DB36/XXXXX—XXXX山药温和花叶病毒（Yammildmosaicvirus，简称YMMV）马铃薯M病毒（PotatovirusM，简称PVM）菜豆萎焉病毒（Beanwiltvirus，简称BBWV5抽样5.1脱毒组培苗抽样每个茎尖分生组织培养系均应检测。5.2田间抽样5.2.1原原种田和原种田抽样甩蔓期、开花期、收获前2w，采用五点法取样，抽样标准见表1。每株取茎蔓上、中、下部叶片1g~5g。将第一次抽取的样品混合后，原原种抽取20%以上（含）样品进行检测。原种抽取10%以上（含）的样品进行检测。表1抽样数量标准表田块面积（hm2）抽样量抽样最低量（株）面积≤0.1200——5.2.2生产用种田抽样开花期及收获前2w，取样检测。抽样标准见表2。每株取茎蔓上、中、下部叶片1g~5g。将第一次抽取的样品混合后，抽取5%以上（含）样品进行检测。表2抽样数量标准表种薯（苗）总量，株抽样百分率，%抽样最低数量，株≤10000>100003~5—5.3没有经过田间检测的种薯、零余子、种苗检测抽样数量标准见表3。将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取5%以上（含）的样品检测。表3抽样数量标准表种类种薯（苗）总量抽样百分率，%抽样最低数量种薯≤10000kg100kg>10000kg3~5—零余子≤100kg3~5>100kg—种苗≤10000株>10000株3~5—注：不足抽样最低数量的全部作为混合样品。3DB36/XXXXX—XXXX6RT-PCR检测方法6.1样品处理取样叶片、块茎、零余子等组织100mg，置于研钵中，加液氮研磨至粉末状。6.2总RNA提取用植物RNA提取试剂盒提取样品的总RNA，具体提取步骤按照相应说明书进行。6.3TR-PCR以实验室保存的标准CHYNMV、JYMV、YMMV、PVM和BBWV病毒总RNA为阳性对照，以健康山药叶片或块茎或零余子总RNA为阴性对照，采用特异性引物对待测样品进行检测，具体引物序列见附件B。扩增过程按照RT-PCR一步法试剂盒说明书操作，反应在50μL体系中进行，各组分如下：2×1StepBuffer25μL、PrimeScript1StepEnzymeMix2μL、上下游各1μL、TotalRNA模板1μL，加RNaseFreeddH2O至50μL。扩增程序：50℃反应30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，53~60℃退火30s（病毒引物对应的退火温度见附件B），72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。6.4PCR产物电泳检测取扩增样品5µL，加入1µL6倍上样缓冲液（6×loadingbuffer），混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝胶（含0.05µL/mlEB或Goldview）上样孔中，用0.5×TBE缓冲液在5-8V/cm电压条件下电泳30min。从电泳槽中取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果。6.5试验成立的条件PCR产物经电泳检测，阳性对照目标条带对应位置（见附录B）出现特异性条带。同时，阴性对照和空白对照均没有出现预期大小的特异性条带。6.6结果判定目标条带对应位置出现特异性条带，为阳性。否则，为阴性。7种薯、种苗质量标准各级别种薯（苗）繁殖中植株允许带毒率应符合表4的要求。表4各级别种薯（苗）繁殖中允许带毒率（%）0———4DB36/XXXXX—XXXX—0——0 0A5DB36/XXXXX—XXXX（资料性附录）RT-PCR检测引物、反应体系和反应条件A.1PCR引物病毒特异性引物：病毒引物序列（5’-3’）中国淮山药坏死花叶病毒CHYNMV-FTCAAGCCAAGGGCACCAA240（CHYNMV）CHYNMV-RGACCTCCTCAGTCCATTTCTCC日本淮山药花叶病毒（JYMV）JYMV-FJYMV-RGCTCCAAGTAAAGCAAGGTGTCATCCAGCTCGTAATC300山药温和花叶病毒（YMMV）YMMV-FYMMV-RGGCACACATGCAAATGAARGCCACCAGTAGAGTGAACATAG262马铃薯M病毒（PVM）PVM-FPVM-RACATCTGAGGACATGATGCGCTGAGCTCGGGACCATTCATAC520菜豆萎焉病毒（BBWV）BBWV-FBBWV-RCTAGATGACAGTTCGATGCAAAGTGGCATGTACGCTCTTTCTTG321A.2RT-PCR反应体系50µLRT-PCR反应体系：试剂名称2×1StepBuffer用量25μLPrimeScript1StepEnzymeMix2μL上游引物下游引物RNA模板RNaseFreeddH2O20μLtotalA.3RT-PCR反应条件50μLRT-PCR反应条件：病毒逆转录预变性变性退火延伸延伸30个循环CHYNMVJYMVYMMVPVM50℃30min94℃2min94℃30s60℃30s55℃30s55℃30s55℃30s72℃1min72℃10min6DB36/XXXXX—XXXXBBWV