外泌体研究进展课程03外泌体的鉴定

®第三课外泌体的鉴定《外泌体研究进展》课程解螺旋|

知识金牌外泌体电镜检测外泌体粒径检测内容外泌体标志蛋白检测常见问题知识金牌Western

Blot检测外泌体标志蛋白电镜检测外泌体形态粒径检测外泌体颗粒大小及分布解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长外泌体电镜检测01知识金牌透射电镜原理解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌负染色技术用重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。在电镜观测时，重金属染色的区域是黑暗的，而未被染色的样品颗粒则透明光亮，这种染色方法称为负染技术。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。解螺旋|陪伴医生科研成长Formvar-carbon载网

3.05mm

diameter.知识金牌透射电镜样品台顶端模式图解螺旋|陪伴医生科研成长Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.实物图知识金牌外泌体电镜检测将exosome固定在载样铜网上重悬100,000

×g离心的exosome沉淀到50-100

μl

2%

多聚甲醛； 如果是富集的冰冻exosome，融化并与等量4%PFA混合注：2%

PFA中的exosome可在4℃储存一周将5

μl

exosome悬液加到Formvar-carbon载样铜网上。也可将5到10

μl

exosome悬液滴加到封口膜上，将铜网Formvar膜面朝下放在悬液上；每份

exosome样品准备2-3个铜网。将100μl

PBS加到封口膜上，用镊子将铜网(Formvar膜面朝下)

放在PBS液滴上清洗重要:在所有步骤中，都应保持Formvar膜面湿润，而另一面干燥.注：相同样品的铜网可在同一PBS液滴中清洗将铜网放在50μl

1%

戊二醛液滴上5

min.将铜网放在100μl

ddH2O

2

min（洗8次）解螺旋|陪伴医生科研成长Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.知识金牌外泌体负染色处理及电镜检测将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上pH

7,

5

min将铜网放在50μl甲基纤维素液滴上10

min，冰上操作铜网放到样品台顶端的不锈钢环上，在滤纸上吸去多余液体；空气中干燥5到10

min将铜网装在样品盒子里，80

kV下拍摄电镜照片.解螺旋|陪伴医生科研成长Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.知识金牌外泌体电镜结果Electron-microscopic

observation

of

whole-mounted

exosomes

purified

from

mouse

dendritic

cells.Curr

Protoc

Cell

Biol.

2006

Apr;Chapter

3:Unit

3.22.

doi:

10.1002/0471143030.cb0322s30.茶托型解螺旋|陪伴医生科研成长一侧凹陷的半球形100

nm知识金牌外泌体电镜结果Electron

microscopy

analysis

of

Exos

secreted

by

obese

adipose

tissue

macrophagesCell.

2017

Oct

5;171(2):372-384.e12.

doi:

10.1016/j.cell.2017.08.035.

Epub

2017

Sep

21.茶托型解螺旋|陪伴医生科研成长200

nm知识金牌外泌体电镜结果Nature.

2017

Jun

22;546(7659):498-503.

doi:

10.1038/nature22341.

Epub

2017

Jun

7.解螺旋|陪伴医生科研成长茶托型100

nm知识金牌外泌体电镜结果Characterization

of

neuron-derived

exosomes

by

transmission

electron

microscopy

(TEM)Cell

Res.

2017

Jul;27(7):882-897.

doi:

10.1038/cr.2017.62.

Epub

2017

Apr

21解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果Cancer

Res.

2016

Apr

1;76(7):1770-80.

doi:

10.1158/0008-5472.CAN-15-1625.

Epub

2016

Mar

18.解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果Sci

Rep.

2017

Nov

24;7(1):16214.

doi:

10.1038/s41598-017-15376-8.解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果Sci

Rep.

2016

Nov

7;6:36502.

doi:

10.1038/srep36502.解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果100nmwide-field

EM

imaging

showed

multiple

human

brain

exosomes

of

sizes

ranging

from

50

to

150

nmJ

Biol

Chem.

2012

Dec

14;287(51):43108-15.

doi:

10.1074/jbc.M112.404467.

Epub

2012

Nov

5.解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果Am

J

Respir

Cell

Mol

Biol.

2016

Sep;55(3):450-61.

doi:

10.1165/rcmb.2016-0033OC.解螺旋|陪伴医生科研成长100

nmPurification

of

exosomes

from

equine

neutrophils.

Exosomes

are

visualized

by

electron

microscopy,知识金牌外泌体电镜结果Urinary

exosomes

were

isolated

from

urine

collections

by

differential

ultracentrifugationNephrol

Dial

Transplant.

2015

Sep;30(9):1488-96.

doi:

10.1093/ndt/gfv128.

Epub

2015

Jun

3.解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果Nephrol

Dial

Transplant.

2015

Sep;30(9):1488-96.

doi:

10.1093/ndt/gfv128.

Epub

2015

Jun

3.解螺旋|陪伴医生科研成长500

nm200

nm知识金牌外泌体电镜结果Isolated

exosomes

from

human

pediatric

CPCs

were

identified

via

Transmission

Electron

Microscopy.Circ

Res.

2017

Feb

17;120(4):701-712.

doi:

10.1161/CIRCRESAHA.116.309935.

Epub

2016

Nov

21.解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果Image

of

exosomes

from

HEK293Tcell

medium

through

a

transmission

electron

microscope.Mol

Ther.

2018

Jan

8.

pii:

S1525-0016(18)30008-X.

doi:

10.1016/j.ymthe.2018.01.001.

[Epub

ahead

of

print]解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体电镜结果小结外泌体样结构：1，通常为茶托型或一侧凹陷的半球形2，大小50-150

nm左右；解螺旋|陪伴医生科研成长外泌体粒径检测02知识金牌Nanoparticle

Tracking

Analysis解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌NTA分析仪器Malvern

NanoSight解螺旋|陪伴医生科研成长ZetaViewqNano知识金牌解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌应用案例Biophysical

characterization

of

D283MED

exosomes.Nicomp

370,Particle

Sizing

Systems

Division,

USA解螺旋|陪伴医生科研成长PLoS

One.

2012;7(7):e42064.

doi:

10.1371/journal.pone.0042064.

Epub

2012

Jul

27.Malvern

NanoSight外泌体标志蛋白检测03知识金牌外泌体是细胞分泌的膜性囊泡，右图即为外泌体结构示意图。研究发现，膜上的突起是外泌体的膜蛋白，其在靶向结合过程中有着重要作用。内含物主要是蛋白质和RNA，RNA种类主要是miRNA，其他就是lncRNA、mRNA、tRNA以及一些RNA片段。解螺旋|陪伴医生科研成长外泌体的结构知识金牌外泌体检测时的指标蛋白频率最高的指标：CD63、Tsg101、CD9和CD81常见指标：Alix、HSP70、flotillin

和Syntenin；其他指标：HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT等。解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌应用案例Nature.

2017

Aug

3;548(7665):52-57.Cell.

2017

Oct

5;171(2):372-384解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌外泌体WB检测中有没有内参？解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌文献报道的抗体公司解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长CD63

抗体的供应商：文献报道较多的两个公司Abcam

(ab68418和ab8219)

和Santa

Cruz

(sc-5275)，其他公司有Systems

Biosciences

Inc、Abnova

(clone

MEM-259)、BD

Pharmingen

(551458)。Tsg101抗体的供应商：文献报道较多的两个公司Abcam（ab125011）和Santa

Cruz

（sc-7964），其他公司有Thermo

Pierce和Sigma-Aldrich。CD9抗体的供应商：文献报道较多的是Abcam

(ab92726)，其他的公司有Santa

Cruz和Systems

Biosciences

Inc。CD81抗体的供应商：文献报道较多的是Santa

Cruz

(sc-9158和H-121)，其他的公司有Novus

Biologicals

(Cat#

NB100–65805)、ImmunoWay。Alix抗体的供应商：文献报道的公司有Cell

Signaling

(#2171)、Santa

Cruz、Abcam。HSP70抗体的供应商：文献报道的公司有Abcam

(ab19136)、Santa

Cruz

(sc-24)。flotillin抗体的供应商:

文献报道的公司有BD

Bioscience。Syntenin抗体的供应商：文献报道的公司有ThermoFisher

Scientific

(Cat#

PA5-28826)

和Abcam

(ab133267)。常见问题04知识金牌存储温度对外泌体有影响吗？Effects

of

storage

conditio