实验三-水及食品中微生物的检测

实验三水及食品中微生物的检测生物11赵晓云34号食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。它不仅是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境,能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据,提供传染病和人类，动物和食物中毒的防治措施。食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。大肠菌群是指在37℃条件下24h内能够发酵乳糖产酸产气的无芽孢革兰阴性杆菌，主要包括肠杆菌科的4个属即埃希氏菌属(Escherichia)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和肠杆菌属(Enterobacter)的细菌。[1]该类细菌主要来源于人和温血动物的粪便，故将大肠菌群作为食品被人和温血动物粪便污染的指示菌来评价食品的卫生质量。食品中大肠菌群值的高低，表明该食品被粪便污染的程度，也反映对人体健康危害性的大小。因此大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。1材料与仪器1.1材料样品：湖水、黄酒。1.2培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、伊红美蓝固体培养基、乳糖发酵培养基。1.2.1肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水100ml、pH7.2、0.10Mpa灭菌20min。如配制固体培养基需加琼脂1.5%~2%；如配制半固体培养基则加琼脂0.7%~0.8%。1.2.2乳糖胆盐发酵培养基(单料)蛋白胨20g、乳糖10g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g、0.04%溴甲酚紫水溶液25ml、蒸馏水1000ml、pH7.4。配制方法如下：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每10ml，并倒置放入杜氏小管(注意排净小管内气泡)，115℃1.2.3乳糖发酵培养基蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25ml、蒸馏水1000ml、pH7.4。配制时将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并倒置放入杜氏小管(注意排净小管内气泡)，115℃1.2.4伊红美蓝固体培养基伊红美蓝固体培养基是一种鉴别培养基，常用于食品及饮用水的微生物学检验，培养基中的伊红为酸性燃料，美蓝则为碱性染料，当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，细菌带正电荷，与伊红染色，再与美蓝结合生产紫黑色化合物。在此培养基上大肠杆菌生长形成呈紫黑色带金属光泽的小菌落，而产气杆菌则形成棕色大菌落，不能发酵乳糖的细菌产碱性物质较多，带负电荷，与美蓝结合形成兰色菌落。其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、20%乳糖溶液20ml、2%伊红溶液20ml、0.5%美蓝溶液10ml、水1000ml、琼脂20g、pH7.6。配制时将牛肉膏、蛋白胨、NaCl加入水中溶解，调pH为7.6，加琼脂、融化、分装、灭菌。再以无菌操作加入预先0.075MPa灭菌20min的20%乳糖溶液20ml、2%伊红溶液20ml、0.5%美蓝溶液10ml。当培养基冷却到50℃1.3实验仪器显微镜、培养箱、水浴锅、培养皿、吸管、接种环、试管、杜氏小管、涂布器、酒精灯、试管架等。实验方法2.1细菌总数的测定2.1.1采样瓶装发酵酒的取样方法：用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开，含有二氧化碳的酒类可倒入500ml灭菌磨口瓶中，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻振荡，待气体全部逸出后，进行检验。水样的采取方法：自来水应先将自来水龙头用火焰灼烧3min，再打开水龙头，使水自流5min，用无菌三角瓶接取水样，塞上塞子备用。池水、河水或湖水应取距水面10~15cm的深层水样，将无菌带玻璃塞的广口瓶浸入水中，盛满后将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检验，否则必须放入冰箱中保存。2.1.2检样稀释(无菌操作)将被检样25g(或25ml或1ml)剪碎，放入含有225ml(或9毫升)无菌生理盐水(或无菌水)的无菌三角瓶(瓶内放置适当数量的玻璃珠)或无菌研钵内，经充分振荡或研磨，制成10-1稀释液。用1ml吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管臂慢慢注入含有9ml无菌生理盐水或无菌水的试管内，制成10-2的稀释液，同法，直到用最后稀释度的菌液做倾注法平皿计数时，每个培养皿的菌落数在30~300之间。2.1.3倾注培养根据食品卫生标准要求或对被检样品所含菌体浓度的估计或通过预备实验，选择2~3个适宜稀释度，从稀释度最高的悬浮液取1ml放入平皿内，每个稀释度作2~3个平皿。稀释液移入平皿后，及时将保温至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基或其他细菌培养基注入平皿约15ml，并摇动平皿使培养基和菌液混匀，待凝固后将平皿倒置于36±1℃培养箱内培养242.1.4菌落计数方法可用肉眼观察直接计数，也可用菌落计数器计数。求出同稀释度的各平板平均菌落数。2.平板菌落数的选择：选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准，取同一稀释度的2~3个平板的平均值。若有的平板上有较大片菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平板后乘以2代表整个平板的菌落数。稀释度的选择参见表1。表1菌落总数计算方法报告方式例子不同稀释度的平均菌落数菌落总平均数及其报告方式(个/ml或个/g)备注10-110-210-3两个稀释度菌落数之比1136516420－16400或1.6×1042多不可计295461.637750或3.8×1023多不可计271602.227100或2.7×1044多不可计1650513—513000或5.1×105527115—270或2.7×1026000—<1×10或<17多不可计30512—30500或3.1×104首先选择平均菌落数在30~300之间的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该稀释度的平均菌落数乘以其稀释倍数进行报告。若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应取两个稀释度的平均数；若大于2，则取其中较少的菌落数进行报告。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释数最低的平均菌落数报告之。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，大于300或小于30，则以最接近30或300的菌落数乘以稀释度报告之。菌落数的报告：当菌落数在100以内时，按其实际数值进行报告；当大于100时，采用两位有效数字进行报告，两位有效数字后面的数值，以四舍五入的方法计算，为了缩短数字后面的零数，可用10的指数来表示。2.2大肠菌群检验大肠菌群检验程序见图1。被检样品被检样品稀释稀释乳糖胆盐发酵管36乳糖胆盐发酵管36±1℃24±不产气产气不产气产气大肠菌群阴性伊红美蓝琼脂平板36大肠菌群阴性伊红美蓝琼脂平板36±1℃报告报告乳糖发酵管革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏染色不产气产气革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阳性不产气产气革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阳性大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阳性报告报告报告报告报告报告图1大肠菌群检验程序2.2.1检样稀释无菌操作将检样25ml(或25g)放入装有225ml无菌生理盐水的无菌三角瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或无菌研钵内，经充分振摇或研磨制成10-1稀释度的稀释液。用1ml无菌吸管吸取上述稀释液1ml，注入含有9ml无菌生理盐水的试管内，振摇混匀，制成10-2的稀释液。另取1ml无菌吸管，按上述方法依次做10倍递增稀释液，每次换用1支1ml无菌吸管。根据食品卫生标准要求或对被检样品污染情况估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。2.2.2乳糖胆盐发酵[2]将被检样品接种乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36±1℃培养箱内，培养24±2.2.3分离培养将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃复发酵证实试验在伊红美蓝琼脂平板上挑取①紫红色，具有金属光泽的菌落；②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡红色，中心较深的菌落。具有以上特征的菌落为可疑大肠菌群菌落，挑取1~2个进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，36±1℃培养24±结果与分析3.1细菌总数的测定取湖水、黄酒稀释度为10-4和10-5的稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基内混合培养，每一稀释度2个平板。结果如表2，表3所示。根据菌落技术报告中的“④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释数最低的平均菌落数报告之”得，本次实验中，湖水细菌总数（取两位有效数字）为0.5×105个/ml，黄酒细菌总数＜1×104个/ml。表2湖水倾注培养结果稀释度菌落数平皿号10-410-5备注100201平均00.5表3黄酒倾注培养结果稀释度菌落数平皿号10-410-5备注100200平均003.2大肠菌群检验3.2.1分别取黄酒、湖水1、10-1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，于36±1℃的恒温箱里倒置培养24±2h，结果如表4和表5所示。表4湖水乳糖胆盐发酵接种量(ml)1号管2号管3号管1产气产气产气0.1产气产气产气0.01产气产气产气表5黄酒乳糖胆盐发酵接种量(ml)1号管2号管3号管1不产气不产气不产气0.1不产气不产气不产气0.01不产气不产气不产气用湖水进行乳糖胆盐发酵，结果显示都产气、产酸，再将其进行分离培养。而用黄酒进行乳糖胆盐发酵，结果显示都不产气、不产酸，报告为大肠菌群阴性。3.将产气的湖水发酵管分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃恒温箱倒置培养18-24h。观察菌落形态。结果如表6所示。表6湖水伊红美蓝固体培养基分离培养接种量(ml)1号管2号管3号管1有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落0.1有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落0.01有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落3.2.对分离培养得到的紫红色，具金属光泽的菌落进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，于36±1℃的恒温箱倒置培养24±2h，观察产气情况。表7湖水革兰氏染色及乳糖复发酵结果接种量(ml)1号管2号管3号管1G-；产气G-；产气G-；产气0.1G-；产气G-；产气G-；产气0.01G-；产气G-；产气G-；产气结果如表表7所示，表明所有管均为大肠菌群阳性管。查大肠杆菌最可能数(MPN)检索表可知，每100ml湖水大肠菌群最可能数（MPN）超过24000个，每100ml黄酒MPN不超过30个。4讨论食品中的微生物有许多种类，有的可导致人类产生疾病，有的对人类无害，也有的可产生一些不能令人忽视的代谢产物，因此食品中的微生物，尤其是一些致病微生物常常是作为人类是否能够食用该食品的重要指标。而对于水及食品中大肠杆菌的快速测定也迫在眉睫。本实验所采用的方法与赵贵明等人所采用的方法一致，均为MPN法，所得实验结果一