基因治疗(生物化学)省公开课一等奖全国示范课微课金奖

基因治疗基因治疗（genetherapy）是向靶细胞导入外源基因，以纠正或赔偿基因缺点，到达治疗遗传病目标。人类遗传疾病5000各种，基本上不可能用常规方法治疗。个别病例只能对症疗法，减轻症状，不能治愈。基因治疗可能是唯一方法。1990年美国重组DNA咨询委员会同意治疗腺苷脱氨酶（ADA）临床治疗方案，2个病例症状改进。1991年复旦大学与二军大学合作用基因疗法治疗血友病B，患者症状有所改进1第1页一、基因治疗类型

1.基因调控治疗从基因水平调控缺点基因表示，改进症状镰型细胞贫血症---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而关闭γ基因重新开放，产生HbF代替HbA用反义RNA抑制基因表示核酶（ribozyme）切割RNA阻断基因表示肿瘤治疗，在基因水平抑制肿瘤细胞基因恶性表示和引导肿瘤细胞逆转。2第2页基因治疗类型（续）2.基因矫正治疗

基因增补—正常基因导入患者体内赔偿缺点基因功效基因替换—以正常基因取代变异基因基因校正—体外对异常基因进行纠正。3第3页基因治疗类型（续）按矫正基因类型分为两种基因治疗：

·生殖细胞基因治疗—对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。

·体细胞基因治疗—以体细胞为受体细胞，不影响下一代惯用细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因修饰，再将其输入体内。4第4页基因置换（genereplacement）

定义：将特定目标基因导入特定细胞，经过定位重组，导入正常基因，以置换基因组内原有缺点基因。

目标：将缺点基因异常序列进行桥正。对缺点基因缺点部位进行准确原位修复，不包括基因组任何改变。5第5页定向整合条件:转导基因载体与基因组DNA含有相同序列。带有目标基因载体就能找到同源重组位点，进行部分基因序列交换。基因同源重组技术又称为基因打靶(genetargeting）细胞内基因同源重组发生率很低。基因同源重组技术6第6页基因增补（geneaugmentation）

定义:经过导入外源基因使靶细胞表示其本身不表示基因。类型:有缺点基因细胞中导入正常基因，而细胞内缺点基因并未除去，经过导入正常基因表示产物，赔偿缺点基因功效；向靶细胞中导入靶细胞原来不表示基因，利用其表示产物到达治疗疾病目标。7第7页基因干预（geneinterference）基因失活

定义：采取特定方式抑制某个基因表示，或者经过破坏某个基因结构而使之不能表示，以到达治疗疾病目标。8第8页（一）反义RNA（antisenseRNA）

1.反义RNA与基因表示调控利用反义RNA对体外培养细胞进行基因表示调控，通常采取方法有两种：

（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义RNA重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。9第9页反义RNA技转移术①受体介导RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移RNA是被保护，与周围环境之间存在多聚赖氨酸保护层,能够抵抗环境中核酸酶降解作用。借助前述受体介导基因转移方法，能够实现受体介导反义RNA转移。10第10页反义RNA优点

受体介导反义RNA基因治疗有其本身优点，而在一定程度上补充了转基因治疗不足。

（l）安全性高（2）反义RNA设计和制备方便

（3）含有剂量调整效应

（4）能直接作用于一些RNA病毒11第11页核酶(ribozyme)

天然核酶多为单一RNA分子，含有自我剪切作用。但核酶也能够由两个RNA分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，经过破坏靶RNA分子而到达治疗疾病目标。

12第12页核酶锤头状二级、三级结构只要两个RNA分子经过互补序列相结合，形成锤头状二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶关键序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。目录13第13页1.核酶设计核酶是经过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。

（1）选择适当靶部位，该部位含有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核酶基本组成：用于基因治疗核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。14第14页干扰RNA

1.RNA干扰现象RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一个由双链RNA诱发基因缄默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因表示。有义RNA（senseRNA）或反义RNA（antisenseRNA）均能抑制线虫基因表示，双链RNA比单链RNA更为有效。这与传统上对反义RNA技术解释恰好相反。而且其抑制基因表示效率比反义RNA最少高2个数量级。

15第15页2.RNA干扰机制

RNA干扰过程主要有2个步骤：

（1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内一些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导缄默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。16第16页研究基因功效新工具

因为RNA干扰技术含有高度序列专一性和有效干扰能力，能够使特定基因缄默或功效丧失，所以能够作为功效基因组学一个强有力研究工具。

RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因表示，建立各种表型；抑制基因表示时间能够控制在发育任何阶段。

17第17页1.体外化学合成;2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。siRNA产生18第18页定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码酶能使无毒性药品前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而到达去除肿瘤细胞目标。应用：是恶性肿瘤基因治疗主要方法。（四）自杀基因治疗(SuicideGeneTherapy)19第19页

（五）基因免疫调整经过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免疫反应。20第20页二、基因治疗条件

·对导入基因及其产物有详尽了解；

·外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表示；

·不影响受治细胞基因组及表示调控；

导入基因方法安全，载体对靶细胞无害；21第21页三、基因治疗标准对象是病情严重、预后差、别无他法患者转移基因被克隆无需高水平表示和准确定量控制就有治疗效果靶细胞获取或回输安全转移基因表示对细胞微环境无严格特异性要求22第22页四、基因疗法步骤

目标（治疗）基因选择依据基因治疗类型选择对应目标基因（增补、替换、添加）基因载体构建使目标基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表示

受体细胞选择易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞23第23页

基因转移(genetransfer)方法

1.病毒介导基因转移2.非病毒介导基因转移24第24页

1.病毒介导基因转移系统病毒载体介导基因转移效率较高据统计，有72%临床试验计划和71%病例使用了病毒载体，其中用得最多是反转录病毒载体。25第25页反转录病毒结构及生活周期（1）反转录病毒

26第26页

（2）腺病毒(adenovirus)载体

经过受体介导内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染病原体，还未发觉与肿瘤发生相关联。27第27页惯用基因治疗载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞<5kb<7.5kb28第28页2.非病毒载体介导基因转移系统

（1）脂质体介导基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:

利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋外源DNA脂质体，然后与细胞一起孵育，即可经过细胞内吞作用将外源DNA（即目标基因）转移至细胞内，并进行表示。

29第29页（2）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性配体偶联，可使DNA含有靶向性。这种偶联通常经过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又经过电荷相互作用与带负电荷DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这么形成复合物可被带有特异性受体靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。30第30页

（3）基因直接注射技术

不需要进行基因工程繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或一些器官组织内。动物试验表明：接收注射外源DNA小鼠能够按其基因编码合成对应蛋白质，并能维持数月之久。

将促进心脏血管生长基因直接注入试验鼠心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺乏胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需凝血因子Ⅸ。31第31页

基因直接注射法优点制备含有调控部件质粒DNA重组体技术较轻易；排除病毒载体可能潜在致癌性或其它副作用；导入基因不需整合即可表示，防止了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转缺点；基因直接注射法可重复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使重复治疗效果下降。

32第32页五、基因治疗应用治疗恶性肿瘤

治疗黑色素瘤--将已导入IL2基因TIL细胞回输给病人，开启本身免疫治疗艾滋病--用射线照射已导入HIV基因成纤维细胞，细胞停顿分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤HIV感染细胞。治疗家族性高胆固醇血症（FH）

肝细胞低密度脂蛋白（LDL）受体基因混乱造成，将LDL基因导入病人离体培养肝细