(高清版)DB21∕T 2451-2015 玉米品种真实性鉴定 SSR分子检测方法

玉米品种真实性鉴定SSR分子检测方法205-C4-O发布2015-6-O1实施辽宁省质量技术监督局发布I前言 1范围 12规范性引用文件 13术语、定义和缩略语 14方法原理 25仪器设备、试剂和溶液配制 26检测步骤 37结果分析和表示 68结果判定 6附录A(规范性附录)核心引物名称和序列 7附录B(规范性附录)溶液配制 9本标准按照ET1.1-20哈出的规则起草。本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准起草单位：辽宁省种子管理局。本标准起草人：朱志成、李波、高振环、邹畅、肖国峰、王汝宝、李洪建、赵前程、王见中、温浩、李鹏、史鸿儒、安辉、徐策、孙丽红、王东坡。11范围件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。BT35432农作物种子检验规程扦样3术语、定义和缩略语31术语和定义32缩略语2CTAB:cetyltrimethylammoniumbromide,十DNA:deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。dNTPs:deoxyribonucleosidetriphSDS:sodiumdodecylsulfate,十二烷基苯磺酸钠。SSR:simplesequence4方法原理5仪器设备、试剂和溶液配制51.2毛细管电泳检测平台52试剂CAB三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTANy2H0、三羟甲基氨基甲烷(Trisbace)、37%的盐酸、氢氧化钠(NEOH、氯化钠(NC)、dNTPs.Taq(bisaoryaide)、丙烯酰胺(arylaide)、硼酸(BricAid、尿素、亲和硅烷(BndrgSlare)、疏水硅烷(RepeSlare)、DA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺(TEND、过硫酸铵(AS)、CAB三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(DTANay2-0、三羟甲基氨基甲烷(Trisbae)、3%的盐酸、53溶液配制3DB2V/T2DNA提取、PCR扩增、电泳以及银染溶液按照附录B(规范性附录)规定的要求6检测步骤61送验样品及DNA提取送验样品为种子，重量不低于2mg或不少于5D粒。送验样品为果穗，应不低于5个果穗(总粒数不低于5D粒);送验样品为幼苗、叶片或苞叶的，应至少含有40个个体。移入20rt离心管。每管加入TOIL经65C预热的CAB提取液，充分混匀，65C水浴60in充分混匀。每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(241)混合液，充分混合后静置10in在120p条件下后在4C、120Drpm条件下离心10in弃上清液，加入TO6醇溶液，旋转2次后弃去乙醇溶液，并倒立于垫有滤纸的实验台上，室温放置10rin以上。加入10L超纯水或正缓冲液1,充分溶解后备3OLSDS提取液，混匀后在100pm条件下离心2in吸取上清液，转移至预先装有3OL异丙醇E缓冲液1,充分溶解后备用。61.23碱煮法孔板中。每孔加入15QL氢氧化钠溶液，煮沸Sin然后加入15QLE缓冲液2充分溶解后备用。61.24试剂盒法462PCR扩增单引物电泳。选用毛细管电泳，合成引物时需在上游引物的5端标记荧光染料，可采用单引物电泳或原浓度终浓度体积(μL)一22引物263扩增产物检测取10b4BBAE胶，加入TEND631.2变性5DB2V/T2a)正极槽(下槽)加入1×TE缓冲液60b负极槽(上槽)加入经65C预热的1×T任缓冲液60tb用移液器清除加样槽孔气泡和杂质，插入样品梳(鲨鱼齿朝下),每一个加样孔点入5L样品d达到电泳时间后关闭电源，结束电泳，取下玻璃板并轻轻撬开，通常凝胶附着在无凹槽的玻璃板上。631.4染色将胶板放入显影液中，轻轻晃动待条带清晰后取632荧光毛细管电泳检测用孔板孔中，各孔再分别加入O1μL分子量内标和89μL去离子甲酰胺。在PR仪上另℃变性5in打开DN分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液、灌胶。将装有样品的微孔板放置于样品架基座件。67结果分析和表示位点差异记录分为下列三种情形：——位点存在差异的或完全相同的，记录为有差异或无差异；——位点数据缺失的，记录为缺失；——位点显示无法判定的，记录为无法判定。检验结果用比较供检样品和对照样品的位点差异数目表示。统计位点差异记录的结果，计算比较位点数、差异位点数及差异位点。供检样品和对照样品的差异位点数目≥3,判定为与对照样品不相符。供检样品和标准样品的差异位点数目<3判定为与对照样品相符。属于下列情形之一的，需要在检验报告中注明：——采用的对照样品数据来自对照样品DNA指纹数据库的；——使用特异引物进行检测的，应提供该特异引物的序列信息。7编号引物名称分组引物序列荧光染料I上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCII下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACI上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCI下游：ATGGACTCTGTGCGACI上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCI上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGGI上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCI上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAGII下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCI上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCACI上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTII上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACI下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTCI下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACCI上游：GCGGAAGAGTAGICGTAGGGCTAGIGTAG下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGI下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGCI下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACACⅡ上游：AAGAACAGGACTACATG下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCⅡ8Ⅱ下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCCⅡ上游：TGATAGGTAGTTAGCATAT下游：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGCⅡ上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGⅡ上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTⅡⅡ上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGCⅡ下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGⅡ上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGⅡⅡ上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTⅡ上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTⅡ下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCⅡ上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTⅡ下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCⅡ上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCⅡ下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCⅡ下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGACⅡ上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC下游：CTTCGTACCATCTTC