《蛋白表达纯化》课件

蛋白表达纯化欢迎参加蛋白表达纯化课程。本课程将深入探讨蛋白质表达和纯化的关键技术，为您的研究工作提供实用指导。课程目标全面理解掌握蛋白质表达和纯化的基本原理与方法。实践技能学习各种表达系统和纯化技术的操作步骤。问题解决培养优化蛋白质产量和纯度的能力。应用拓展了解蛋白质研究的最新进展和应用前景。蛋白质概述结构单元蛋白质是生命的基本构建模块，由氨基酸链组成。功能多样蛋白质在生物体内执行各种关键功能，如催化、信号传导等。基因产物蛋白质是基因表达的最终产物，反映遗传信息。蛋白质结构1四级结构多个亚基的组合2三级结构多肽链的三维折叠3二级结构α螺旋和β折叠4一级结构氨基酸序列蛋白质功能酶催化加速生化反应，如消化酶分解食物。信号传导激素和受体蛋白参与细胞间通讯。结构支持如肌动蛋白和肌球蛋白构成肌肉纤维。免疫防御抗体蛋白识别和中和外来病原体。蛋白质表达系统原核表达大肠杆菌表达系统，适合简单蛋白质。真核表达酵母、昆虫和哺乳动物细胞系统，适合复杂蛋白质。无细胞表达体外快速表达系统，适合特殊蛋白质。大肠杆菌表达系统1优势生长快速，表达量高，成本低。2局限性不适合表达复杂糖蛋白或膜蛋白。3应用广泛用于简单蛋白质的大量生产。酵母表达系统选择菌株选择合适的酵母菌株，如酿酒酵母。构建载体设计并构建表达载体，插入目标基因。转化培养将载体转化入酵母细胞，筛选阳性克隆。诱导表达添加诱导剂，促进目标蛋白表达。昆虫细胞表达系统1构建杆状病毒将目标基因插入杆状病毒基因组。2感染昆虫细胞用重组病毒感染昆虫细胞，如Sf9细胞。3蛋白质表达感染细胞大量表达目标蛋白质。4收集纯化收集培养上清或裂解细胞，纯化目标蛋白。哺乳动物细胞表达系统基因构建设计哺乳动物表达载体，插入目标基因。细胞培养培养HEK293或CHO等哺乳动物细胞系。转染表达使用脂质体或病毒介导转染，诱导表达。蛋白质表达策略1优化表达条件调整温度、pH和诱导时间。2融合标签设计添加His标签或GST标签辅助纯化。3密码子优化根据宿主偏好性优化基因序列。4表达系统选择根据蛋白特性选择合适表达系统。突变体构建定点突变改变特定氨基酸，研究其功能。使用PCR或基因合成技术实现。截短突变删除蛋白质的某些区域，研究结构域功能。常用于提高可溶性。插入突变在蛋白质中插入新的氨基酸序列，如标签或功能域。转化与筛选1制备感受态细胞处理宿主细胞，使其能够吸收外源DNA。2转化将重组质粒导入感受态细胞。3平板筛选在含抗生素的培养基上筛选阳性转化子。4鉴定验证通过PCR或测序确认目标基因的存在。诱导表达IPTG诱导用于lac操纵子控制的表达系统，如pET系统。甲醇诱导常用于毕赤酵母表达系统。四环素诱导用于Tet操纵子控制的表达系统。热激诱导利用热激启动子控制表达。细胞裂解超声破碎利用超声波破坏细胞膜，适用于小规模样品。高压均质通过高压使细胞破裂，适合大规模制备。冻融法反复冻融使细胞破裂，温和但效率较低。蛋白质分离离心分离去除细胞碎片和不溶性物质。沉淀分离利用盐析或有机溶剂沉淀目标蛋白。膜过滤使用不同孔径的膜分离不同大小的蛋白。层析分离根据蛋白质性质进行精细分离。层析技术亲和层析原理利用蛋白质与特定配体的特异性结合进行分离。常用标签His标签、GST标签、FLAG标签等。洗脱方法竞争性洗脱或pH变化洗脱。离子交换层析阳离子交换分离带正电荷的蛋白质。阴离子交换分离带负电荷的蛋白质。pH影响通过调节pH改变蛋白质电荷。盐梯度洗脱使用递增的盐浓度梯度洗脱蛋白质。凝胶过滤层析1原理根据蛋白质分子大小进行分离。2优势可用于蛋白质脱盐和分子量测定。3局限性分辨率较低，不适合分离相近大小的蛋白。4应用常用于蛋白质纯化的最后一步。反相层析原理基于蛋白质疏水性差异进行分离。固定相通常使用C18或C8修饰的硅胶。洗脱使用有机溶剂浓度梯度洗脱。纯化过程优化1条件筛选优化缓冲液、pH和盐浓度。2多步策略组合不同纯化方法提高纯度。3添加剂使用使用还原剂或稳定剂提高蛋白质稳定性。4流程自动化利用FPLC系统提高效率和重复性。纯度分析电泳分析SDS评估蛋白质纯度和分子量。色谱分析HPLC或SEC评估纯度和聚集状态。质谱分析精确测定蛋白质分子量和修饰。SDS样品制备蛋白质与SDS变性，加热处理。电泳分离在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。染色显色使用考马斯亮蓝或银染色显示蛋白质条带。结果分析根据条带数量和强度评估纯度。Westernblot1电泳分离SDS分离蛋白质。2转膜将蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上。3抗体杂交使用特异性抗体检测目标蛋白。4显影检测使用化学发光或荧光方法检测信号。ELISA直接ELISA抗原直接吸附于板上，用标记抗体检测。间接ELISA使用未标记一抗和标记二抗检测。夹心ELISA用捕获抗体和检测抗体夹心检测抗原。竞争ELISA样品抗原与标记抗原竞争结合抗体。活性测定酶活性测定测量底物转化率或产物生成速率。结合活性测定评估蛋白质与配体的亲和力。细胞功能测定观察蛋白质对细胞行为的影响。蛋白质结构表征X射线晶体学高分辨率解析蛋白质三维结构。需要获得高质量晶体。核磁共振(NMR)在溶液状态下研究蛋白质结构和动力学。适用于小型蛋白。冷冻电镜观察大型蛋白复合物的结构。近年来分辨率显著提高。结构预测序列同源性建模基于已知同源蛋白结构预测目标蛋白结构。从头预测仅依据氨基酸序列预测三维结构。人工智能方法如AlphaFold2，利用深度学习预测蛋白质结构。分子动力学模拟模拟蛋白质在溶液中的动态行为。结构确定1功能解析基于结构推测蛋白质功能2结构精修优化初始模型3数据收集X射线衍射或NMR谱图4样品制备蛋白质结晶或同位素标记应用案例分享胰岛素生产重组DNA技术大规模生产人胰岛素，治疗糖尿病。单克隆抗体利用哺乳动物细胞表达系统生产治疗性抗体。CRISPR/