晚期氧化蛋白产物（AOPP）检测试剂盒实验解决方案

晚期氧化蛋白产物（AOPP）检测试剂盒实验解决方案原理晚期氧化蛋白产物（AOPP）是新近发现的一类具有促炎活性的尿毒症毒素，是血浆蛋白遭受活性氧系（ROS）攻击后形成的氧化修饰产物。AOPP能激发单核细胞和中性粒细胞，刺激以肿瘤坏死因子TNF-ɑ为主的大量促炎性细胞因子的合成、释放，促进产生更多的活性氧，从而诱导和加重全身氧化应激和炎症状态。AOPP与晚期糖基化终末产物（AdvancedGlycationEnd-Product,AGE）蛋白很相似，也发挥着相似生物功能。AOPP是肾并发症、动脉粥样硬化、糖尿病、代谢综合征、免疫性疾病和恶性肿瘤等疾病的重要检测指标。CheKine™晚期氧化蛋白产物（AOPP）检测试剂盒（微量法）可定量检测血浆、血清、动物组织和细胞等样本中AOPP的含量。样品或标准品与引发剂和终止液反应，产物在340nm处有吸收峰，通过检测340nm处OD值，通过与标准曲线比对，确定样品中AOPP的含量。自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·制冰机、低温离心机、水浴锅·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer(1×)：临用前配制，用去离子水按1:9稀释至1×，混匀备用。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：ReagentⅡ和Standard有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。WorkingAOPP-HSAPositiveControl：临用前配制，用ExtractionBuffer(1×)按1:19稀释，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。WorkingFree-HSANegativeControl：临用前配制，用ExtractionBuffer(1×)按1:19稀释，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。标准曲线设置：按照如下表格，用去离子水将1,000µmol/L标准品稀释为100、80、60、40、20、10、5µmol/L的标准溶液。序号1,000µmol/L标准品体积（µL）去离子水体积（µL）标准品浓度（µmol/L）Std.1100900100Std.28092080Std.36094060Std.44096040Std.52098020Std.61099010Std.759955Std.801,0000注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。样本制备1.细胞：收集细胞到离心管内，弃上清，按照每500万个细胞加入1mLExtractionBuffer(1×)，超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），13,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。2.动植物组织：称取约0.1g组织，加入1mLExtractionBuffer(1×)，进行冰浴匀浆，13,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。3.血清和血浆：用ExtractionBuffer(1×)稀释5倍后直接检测。注意：如需用蛋白浓度计算，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。紫外分光光度计用去离子水调零。2.96孔UV板或微量石英比色皿中按顺序加入下列试剂：试剂测定孔（μL）空白孔（μL）标准孔（μL）阳性对照孔（选做）（μL）阴性对照孔（选做）（μL）样本2000000ExtractionBuffer（1×）0200000WorkingAOPP-HSAPositiveControl0002000WorkingFree-HSANegativeControl0000200Standard0020000ReagentⅠ1010101010ReagentⅡ2020202020混匀，37℃孵育5min，记录340nm处的吸光值，计算测定孔ΔA测=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白，阳性对照孔ΔA阳对=A阳对-A空白和阴性对照孔ΔA阴对=A阴对-A空白。注意：对照孔、空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.002可适当加大样本量。如果ΔA测定大于100µmol/L的ΔA标准，样本可用ExtractionBuffer(1×)进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.以各标准品浓度为y轴，ΔA标准为x轴，做标准曲线得到方程，将ΔA测带入方程，得到y(µmoL/L)。2.样本中AOPP浓度计算(1)按照蛋白浓度计算AOPP含量(µmol/g)=(y×V样)÷(V样×Cpr)×稀释倍数=y÷Cpr×n(2)按照样本质量计算AOPP含量(µmol/g)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×稀释倍数=y÷W÷1,000×n(3)按照血清和血浆计算AOPP含量(µmol/L)=y×n(4)按照细胞密度计算AOPP含量(nmol/104cells)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)=y÷500V样：加入反应体系中样本体积，0.2mL；V提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞总数，500万；n：样品稀释倍数。结果展示Figure1.AOPP标准曲线Figure2.不同样品AOPP检测值Figure3.Free-HSA阴性对照组和AOPP-HSA阳性对照组在340nm检测的OD值相关产品CatalogNo.ProductNameKTB1030CheKine™超氧化物歧化酶（SOD）活力检测试剂盒（微量法）KTB1040Ch