21三体综合征产前诊断

21三体综合征产前诊断From临床17班小组案例张某，女，31岁，商场收银员，怀孕16周，担心所孕胎儿不正常，前来进行遗传咨询。经询问得知，张某的一表姐曾生育一智力低下儿子，经某医院诊断为先天愚型，但具体核型不详。张某孕前检查各项优生指标均正常，孕前无感冒服药史，无有毒有害物质接触史。张某的丈夫，32岁，司机，有烟酒嗜好，在妻子怀孕前半年已戒酒，减少吸烟量。两人核型检查均正常，家族中其他特殊疾病患者。根据张某的情况，作中孕期唐氏筛查，结果张某血清的AFP,hCG和uE3检查结果阳性。根据上述资料和风险评估，张某所孕胎儿具有21三体综合症的高风险，建议进行产前诊断。

孕妇就诊

常规筛查综合分析风险值孕期检查进一步确诊羊膜穿刺荧光原位杂交技术PCR技术结果分析遗传建议羊膜穿刺离心实验流程：羊膜穿刺---羊水中有一定数量胎儿脱落细胞（多为成纤维细胞和上皮细胞）,经体外培养后,可进行染色体分析.酶和蛋白质检测性、染色体检查和提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断。时间：妊娠16~20周步骤：（B超监视下进行）孕妇排空膀胱—腰穿针穿刺—穿过腹壁和子宫 壁进入羊膜腔—抽取羊水荧光原位杂交（FISH）FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.材料

仪器

离心机，水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜。试剂

荧光探针。工作液的配制：（1）20×SSC：氯化钠175g，柠檬酸三钠88.2g，加三蒸水到1000ml。（2）变性液：甲酰胺28ml，20×SSC 4ml，蒸馏水8ml，终体积40ml，充分混匀，调整pH至7.0～8.0,密封保 存于4℃～8℃,每次使用前均需测定pH值。（3）洗脱液：甲酰胺 20ml，20×SSC4ml，蒸馏水16ml，终体积40ml。（4）SSCT： 20×SSC100ml，Tween-200.2ml，加二蒸水至终体积为1000ml。方法1.羊水细胞涂片的制备

抽取羊水5～6ml，1500rpm离心10min，去上清，留羊水细胞沉淀；在细胞沉淀中加3ml0.25%trypsin（溶于无CaCl2的Hanks液），37℃消化30min；2000rpm离心10min，去上清，在沉淀中加入4～5ml0.75mol/LKCl,37℃孵育30min，再加入1ml固定液（甲醇∶冰醋酸为3∶1），轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加5ml固定液，轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加适量固定液，滴片。

2.杂交、洗脱、显色

(1)将pH为7.0～7.5的变性液(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中预热至74℃,将一支干净的温度计插入变性液中以确认温度达到了74℃，注意冷玻片插入变性液中将降低变性液的温度。(2)将玻片插入预热的变性液中3～4min，不要摇动，然后迅速将玻片插入预冷至-20℃的酒精中，依次从70%、90%到100%酒精中各脱水2min。(3)将探针于37℃保温5min，轻轻振动后短暂离心收集液体于管底（不要变性探针）。(4)用刻字笔将标本周围划线，加上10μl探针。盖上盖玻片，在盖玻片周围封上一层rubbercement，将玻片置于湿盒中于37℃杂交过夜。荧光原位杂交技术(5)在水浴中预热40ml洗脱液（50%甲酰胺/2SSC）至43℃，将一支干净的温度计插入洗脱液中证实温度达到43℃。(6)用镊子小心地除去rubbercement，小心揭开盖玻片，将玻片插入洗脱液中洗脱10min，然后再重复一次。洗脱液的温度对于信号强度与特异性非常关键，洗脱液温度不能低于43℃。以免由于交叉杂交导致背景产生。(7)将玻片在37℃的2×SSC中洗脱2次，每次4min。(8)将玻片置于室温SSCT液中洗脱2min。（9）将玻片取出，用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，不要让玻片干掉，以免由于检测试剂的非特异性结合导致高背景荧光。（10）在每块玻片上加上30μlavidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。（11）小心去除盖玻片，将玻片在室温SSCT中洗脱3次，每次2mi（12）用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，加上30mlAnti-avidin于标本上，盖上盖玻片，37℃孵育20min。（13）小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次2min。（14）在每块玻片上加上30μlavidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。（15）小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次2min。（16）用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT加上10μlDAPI，盖上18mm×18mm盖玻片，用一块纸巾盖上盖玻片,小心挤压纸巾以吸去多余的DAPI,注意不要移动盖玻片。3.荧光显微镜下观察.

如图：显示两红两绿的荧光即为正常.

如图：显示三红两绿即为患者。PCR-SSLP技术选用21号染色体的6个具有高度多态性的短串联重复序列（STR）位点为遗传标记，应用pcr—sslp技术，通过pcr扩增和硝酸银进行检测。方法步骤：取羊水2ml------处理离心-----沉淀保留DNApcr扩增：配置扩增体系，调整pcr循环参数电泳分离银染-显色-扩增产物检测结果 正常人在某一str位点可出现两种情况：一．若为杂合子，pcr产物电泳结果显示2条DNA带，密度定量为1:1.二．若为纯合子，pcr产物电泳结果显示1条DNA带。Down综合征患者在某一str位点的检测结果分3种情况：一，显示为3条DNA带，密定量比为1:1:1；二，显示为2条DNA带，密度定量比为2:1；三，显示为1条DNA。前两种提示：该str位点有3个等位基因，可对DOWN综合征作出诊断。第三种提示：三个等位基因纯合型，不能做出诊断，需结合其他STR位点的检测结果综合分析。本研究选6个STR位点分布于21号染色体长臂；D21S16位于21q11.1，D21S11位于21q22.1~q21；D21S1432位于21q21；D21S1437和D21S1270位于DSCR(关键区域)内部，D21S1446位于21q23.30。因此，选用上述6个STR位点，尤其是D21S1437，D21S1270两位点位于DSCR内部，以它们作为遗传标记，采用PCR—SSLP的方法结合定量分析，可以确认，细胞中21号染色体的数目或DSCR的数目，从而对由21三体及部分三体造成的DOWN综合征作出诊断。先天愚型染色体核型分析核型特征一、若结果正常：核型：46，XX(XY)二、若结果异常：1、21三体型（约占92.5%）：有典型的临床表现。核型：47，XX（XY），+21产生原因：父母之一配子发生时减数分裂过程中出现不分离的结果，大多数是母亲卵子形成过程中发生了21号染色体不分离（95%）；父亲精子形成中发生21不分离而致该病约占5%。2、易位型（约占5%）：有典型的临床表现。

常见核型：46，XX（XY），-14，+t（14；21）（p11；q11）3、嵌合型（约占2.5%）：临床症状可以很典型，也可以很轻，主要取决于正常细胞与异常细胞之间的比例。核型：46，XX（XY）/47，XX（XY），+21原因：正常的受精卵在胚胎发育早期卵裂过程中，发生21号染色体的不分离。

综上总结给与遗传建议：若经过实验检查诊断为21三体综合症，就目前的医疗水平而言，21-三体综合征既没有方法治愈也没有方法预防，目前主